蘿卜籽酶解制備蘿卜硫素工藝優(yōu)化及其體外消化研究

李惠琳，劉 昊，李 玨，木耶賽爾·凱代斯，圖爾蓀阿依·圖爾貢，趙 雷，何慶峰,*

（1.和田職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)科技系，新疆維吾爾自治區(qū)和田 848000；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300000）

蘿卜硫素（sulforaphane，1-異硫氰酸酯（4R）-（甲基亞磺?；┒⊥椋?，又稱萊菔硫烷，由十字花科蔬菜及種子中硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GLS）經(jīng)植物黑芥子酶水解而成，屬于異硫氰酸酯中的一類。蘿卜硫素是目前發(fā)現(xiàn)的蔬菜中抗癌效果較強(qiáng)的天然活性物質(zhì)，同時(shí)，其在抗氧化、抗炎等方面也具有獨(dú)特的作用[1]。蘿卜硫素的制備方法主要包括合成法及酶法，前者需要使用大量的有毒有機(jī)試劑，且反應(yīng)過程難以控制，副產(chǎn)物較多，在食品工業(yè)中未能得到廣泛應(yīng)用。而酶法從天然植物中提取的蘿卜硫素安全性更高，更能滿足市場(chǎng)對(duì)功能性食品配料安全性的需求。該法一般包括酶解和提取兩個(gè)過程。酶解步驟中，GLS 經(jīng)植物本身內(nèi)源性黑芥子酶水解轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素。而酶解產(chǎn)物的組成，以及蘿卜硫素得率往往與酶解條件密切聯(lián)系[2]。因此，目前大部分研究重點(diǎn)主要集中在如何調(diào)控酶解條件方面，包括pH、溫度、上皮硫特異蛋白（ESP）活性，酶輔助因子（Fe2+、Na+、Ca2+）、外源激素、抗氧化劑、外源性黑芥子酶等[3-4]。而在提取過程中，較多研究使用丙酮及二氯甲烷等有機(jī)溶劑，而乙酸乙酯的毒性相對(duì)較弱，在蘿卜硫素的提取應(yīng)用中具有一定的研究?jī)r(jià)值[5]。此外，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘿卜硫素植物來源的研究主要集中在十字花科蕓薹屬植物西蘭花，而有關(guān)蘿卜硫素其他植物來源的研究相對(duì)較少。

蘿卜（Raphanus sativusL.）屬于十字花科蘿卜屬植物，在我國(guó)資源豐富，其根部及葉部具有一定的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值，而其種子也被稱為“萊菔子”，更是我國(guó)一種傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材[6]。已有研究表明，蘿卜根莖及種子中含有一定量的蘿卜硫素，是制備蘿卜硫素的潛在天然來源[7-8]。由于酶法制備蘿卜硫素極易受酶解條件的影響，往往需對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。已有少數(shù)學(xué)者研究了酶解蘿卜制備蘿卜硫素的工藝優(yōu)化，例如，陽(yáng)暉等[9]發(fā)現(xiàn)胭脂蘿卜廢渣中提取蘿卜硫素的最優(yōu)酶解工藝為：酶解溫度31 ℃，內(nèi)源酶酶解時(shí)間7.7 h，pH5.6，VC添加量為0.24 mg/kg，此時(shí)蘿卜硫素得率為561.30 μg/g。而王兆玲等[10]發(fā)現(xiàn)蘿卜芽苗中提取還原型蘿卜硫素的最佳酶解條件為：緩沖溶液的pH 為5.79，酶解時(shí)間為49 min，料液比為33.12%，VC含量為6.9 mmol/L，在此條件下還原型蘿卜硫素的得率為7.39 mg/g。但目前尚無關(guān)于酶解蘿卜籽制備蘿卜硫素的工藝優(yōu)化方面的報(bào)道。此外，在作為功能食品配料使用時(shí)，胃腸消化是影響植物提取物活性成分對(duì)機(jī)體發(fā)揮生物效應(yīng)的關(guān)鍵因素[11]。而有關(guān)蘿卜籽蘿卜硫素在胃腸消化過程中含量及抗氧化活性變化規(guī)律的研究鮮有報(bào)道。綜上，本研究以來自大紅蘿卜（RedRaphanus sativus）的種子為原料，在添加自制外源芥子酶，超聲及微波多種輔助條件下，利用內(nèi)源性芥子酶進(jìn)行GLS 酶解轉(zhuǎn)化，以乙酸乙酯為溶劑提取蘿卜硫素。利用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析（Response surface methodology，RSM）法優(yōu)化酶解條件，建立一種安全、可靠的蘿卜籽蘿卜硫素酶法提取工藝。并使用體外胃腸消化模型對(duì)提取物中蘿卜硫素含量及其抗氧化活性的體外消化規(guī)律進(jìn)行了研究。旨在為天然蘿卜硫素的制備方法，以及蘿卜籽的高附加值利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘紅豐一號(hào)’蘿卜種子 購(gòu)于天津農(nóng)科院，于2022 年采集；芥菜籽 購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；蘿卜硫素對(duì)照品（純度＞90%，HPLC） 購(gòu)于天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；胃蛋白酶（30000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、乙酸乙酯 均為分析純，購(gòu)于天津明川生物科技公司。

1100 系列高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司（中國(guó)）；RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科文儀器設(shè)備有限公司；BK-FD10S 型真空冷凍干燥機(jī)BioBASE 博科集團(tuán)；FA-1004 電子分析天平 紹興景邁儀器設(shè)備有限公司；VGT-1730QG 超聲波清洗機(jī) 廣東固特科技有限公司；CYWB-10 微波消解儀 杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-4 電熱恒溫水浴鍋 安瑞醫(yī)療器械有限公司；FW-100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；7200 系列可見光分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘿卜硫素的提取方法

1.2.1.1 外源黑芥子酶液制備 參考胡翠珍等[12]的方法制備黑芥子酶液并測(cè)定其活性。芥菜籽粉碎，過60 目篩，取0.5 g 放入三角瓶中，再加入25 mL 蒸餾水，40 ℃條件下，360 W 超聲波振蕩20 min，過濾除雜，得黑芥子酶粗酶液，測(cè)得酶活為0.891 μmol/（min·g）。

1.2.1.2 蘿卜硫素的制備 參考Tanongkankit 等[13]的方法，略作修改，如下：

前處理：0.2 g 蘿卜種子樣品在研磨機(jī)中粉碎，過40 目篩，并在55 ℃下加熱5 min，然后立即在冰上冷卻，以失活ESP。

脫脂：在培養(yǎng)箱搖動(dòng)器中，用正己烷將種子粉脫脂一段時(shí)間，然后將剩余的種子粉在通風(fēng)櫥中干燥過夜。

酶解轉(zhuǎn)化提取：脫脂后的種子樣品添加10 mL芥子酶粗酶液，然后加入磷酸鉀緩沖液（pH7.0）調(diào)節(jié)料液比（1:20 mg/mL），在酶解體系中加入不同量的抗壞血酸，并使用設(shè)計(jì)的溫度和時(shí)間進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化，超聲提取2 次，每隔5 min 超聲一次，每次超聲30 min。

微波提?。好附夂?，置于微波爐中，37 ℃，500 W提取5 min，隨后，按體積比1:1 加入乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯，4000 r/min 離心20 min，過濾乙酸乙酯層。在40 ℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮至乙酸乙酯完全揮發(fā)，得膏狀蘿卜硫素粗提物，甲醇溶解，冷藏待用。

純化：將蘿卜硫素粗提物用少量丙酮溶解后，過0.45 μm 有機(jī)膜去除雜質(zhì)后，上硅膠SPE 柱（2.5 cm×100 cm，柱體積 400 mL），以丙酮為洗脫溶劑，洗脫體積一般為2 個(gè)保留體積（約400 mL），洗脫流量為2 mL/min，大約每2 h 收集一次餾分（5～10 mL/管），采用薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）檢測(cè)含有蘿卜硫素的餾分，合并這些餾分，冷凍干燥后得到純化后蘿卜硫素樣品。

1.2.2 蘿卜硫素的HPLC 測(cè)定

1.2.2.1 HPLC 檢測(cè) 參照盧旭等[14]的方法，略作改進(jìn)。具體HPLC 條件為：色譜柱為SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈－乙酸（15:85）；流速設(shè)置為0.6 mL/min。進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為35 ℃，使用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.2.2 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取5 mg 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于5 mL 甲醇，配成終濃度為500、250、125、62.5、31.25、0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。濃度由低到高依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。按照以上HPLC 條件進(jìn)行分析。以蘿卜硫素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)Y，以蘿卜硫素出峰面積為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.00003X-0.3102，R2=0.992。

1.2.2.3 蘿卜硫素得率計(jì)算：分別測(cè)定各樣品提取液中的蘿卜硫素含量，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中蘿卜硫素質(zhì)量濃度，各樣品蘿卜硫素得率按公式（1）計(jì)算：

式中：C 為蘿卜硫素提取液質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為復(fù)溶溶液體積（mL）；m 為樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響 準(zhǔn)確稱取蘿卜種子樣品0.2 g，在固定外源酶添加量10 mL，400 W 超聲30 min/次（2 次），500 W 微波5 min 的基礎(chǔ)上，將酶解溫度、VC添加量分別設(shè)定為35 ℃、1.5 mg/g，酶解時(shí)間分別調(diào)為10、20、30、40、50、60 min，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)蘿卜硫素得率的影響 準(zhǔn)確稱取蘿卜種子樣品0.2 g，在固定外源酶添加量10 mL，400 W 超聲30 min/次（2 次），500 W 微波5 min 的基礎(chǔ)上，將酶解時(shí)間、VC添加量分別設(shè)定為20 min、1.5 mg/g，酶解溫度分別調(diào)為25、30、35、40、45、50、55 ℃，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察酶解溫度對(duì)蘿卜硫素得率的影響。

1.2.3.3 VC添加量對(duì)蘿卜硫素得率的影響 準(zhǔn)確稱取蘿卜種子樣品0.2 g，在固定外源酶添加量10 mL，400 W 超聲30 min/次（2 次），500 W 微波5 min 的基礎(chǔ)上，將酶解時(shí)間、酶解溫度分別設(shè)定為20 min、35 ℃，VC添加量分別調(diào)為0.1、0.4、0.7、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/g，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察VC添加量對(duì)蘿卜硫素得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用三因素三水平Box-Behnken 設(shè)計(jì)（BBD）。自變量的范圍及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)的取值范圍內(nèi)，以最大得率為目標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件中的Optimization 功能，確定最優(yōu)酶解工藝條件。使用修正工藝條件，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 體外模擬胃腸消化 在確定的最優(yōu)酶解工藝條件下，按照上述提取條件制備蘿卜硫素乙酸乙酯提取物，并參考Lü等[15]的方法對(duì)其進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn)，主要步驟如下：

胃消化：將1 g 提取物樣品溶解于50 mL 甲醇，用1 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 到2.0 后，加入胃蛋白酶溶液（0.48 g 胃蛋白酶溶解于15 mL 0.1 mol/L HCl）12 mL，恒溫水浴振蕩（37 ℃，160 r/min）2 h 模擬體外胃內(nèi)消化，消化過程避光進(jìn)行。消化結(jié)束后，另一部分在沸水浴中加熱5 min 終止酶解反應(yīng)，冷卻，5000 r/min 離心10 min，收集上清液及殘?jiān)郎y(cè)。

腸消化：胃液消化結(jié)束步驟以后，取30 mL 胃消化液，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 到7.8，加入胰蛋白酶液（0.288 g 胰蛋白酶溶于12 mL pH7.0 的0.01 mol/L PBS 緩沖液中）8 mL，在避光條件下恒溫水浴振蕩2 h 模擬腸道消化（37 ℃，160 r/min），模擬消化結(jié)束后，在沸水浴中加熱5 min，終止酶解反應(yīng)，冷卻，5000 r/min 離心10 min，收集上清液及殘?jiān)郎y(cè)。

1.2.7 胃腸消化對(duì)清除自由基能力的影響

1.2.7.1 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn) 參照郭麗萍等[16]的方法，略有改動(dòng)，具體步驟：取2 mL 消化液樣品，加入2 mL 現(xiàn)配的DPPH 乙醇溶液（0.1 mmol/L），混合均勻，室溫下避光反應(yīng)35 min，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，按公式（2）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A0為DPPH 乙醇溶液吸光度值；A1為DPPH 乙醇溶液和樣品液反應(yīng)液吸光度值；A2為乙醇與樣品溶液混合液吸光度值。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考龍芳[17]的方法，略有改動(dòng)，如下：ABTS 溶液（7 mmol/L）和K2S2O8（2.45 mmol/L）1:1（v/v）混合。在室溫避光條件下放置16 h，用乙醇稀釋混合溶液至734 nm 波長(zhǎng)處吸光值在（0.700±0.005）范圍內(nèi)，即為ABTS+工作液。取50 μL 消化液樣品，加入0.15 mL ABTS+工作液，室溫避光靜置6 min 后測(cè)定734 nm 處的吸光值。按照式（3）計(jì)算清除率。

式中：As為樣品和ABTS+工作液吸光值；Ab為無水乙醇替代ABTS+工作液的吸光度；A0為無水乙醇替代樣品的吸光度。

1.2.7.3 OH 自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考Wang 等[18]的方法，略有改動(dòng)。取1.0 mL 消化液樣品，加入2.0 mL 水楊酸乙醇溶液（6 mmol/L）和2.0 mL FeSO4（6 mmol/L）混合均勻，再加入0.1 mL H2O2溶液（6 mmol/L）于試管中，混勻，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在510 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，按照公式（4）計(jì)算羥基自由基清除率，結(jié)果以羥基自由基清除率（%）表示。

式中：A1為樣品吸光度值；A2為不加顯色劑H2O2吸光度值；A0為空白吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響 如圖1 所示，蘿卜硫素得率在酶解20 min 時(shí)達(dá)到最大（1.55 mg/g），顯著高于10 min 及40～60 min（P＜0.05）。該結(jié)果表明，酶解時(shí)間小于20 min 時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜硫素得率增高，而隨著酶解時(shí)間過長(zhǎng)，得率反而下降。酶解時(shí)間過短，蘿卜硫素提取不充分，得率較低。隨著酶解時(shí)間的增加，蘿卜硫素被充分提取，得率增高。但酶解時(shí)間過長(zhǎng)，蘿卜硫素的降解量超過其生成量，導(dǎo)致得率降低[19]。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響有顯著差異（P＜0.05），其中酶解時(shí)間20 min 時(shí)極顯著，選取酶解時(shí)間10、20、30 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction yield of sulforaphane

2.1.2 酶解溫度對(duì)蘿卜硫素得率的影響 如圖2 所示，隨溫度升高，蘿卜硫素得率先增加后降低（P＜0.05），在40 ℃條件下得率達(dá)到最高值。說明40 ℃為外源芥子酶的最適反應(yīng)溫度。這和Gonzalez 等[20]的研究結(jié)果相似。隨著溫度的繼續(xù)升高，蘿卜硫素得率不斷降低。在適宜的溫度條件下，芥子酶活性高，有利于硫代葡萄糖苷水解生成蘿卜硫素[21]；但當(dāng)溫度過高時(shí)，芥子酶活性大大降低，或高溫使生成的蘿卜硫素部分分解[2]，從而導(dǎo)致得率下降。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，酶解溫度對(duì)蘿卜硫素得率的影響有顯著差異（P＜0.05），其中酶解溫度40 ℃時(shí)極顯著，選取酶解溫度35、40、45 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 酶解溫度對(duì)蘿卜硫素得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction yield of sulforaphane

2.1.3 VC添加量對(duì)蘿卜硫素得率的影響 如圖3 所示，當(dāng)VC添加量達(dá)到0.7 mg/g 時(shí)得率最高，達(dá)到1.75 mg/g，顯著高于VC添加量為0.1、0.4、2.0 及3.0 mg/g 條件下的蘿卜硫素得率（P＜0.05）。該結(jié)果表明較低和較高的VC添加量均不利于蘿卜硫素提取。VC是芥子酶的非競(jìng)爭(zhēng)性激化劑，添加VC濃度適宜，有利于異硫氰酸鹽的生成，提高蘿卜硫素生成量[22]。而VC添加量過高時(shí)，則對(duì)芥子酶活性有一定的抑制作用[23]，從而導(dǎo)致蘿卜硫素的生成量降低。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，VC添加量對(duì)蘿卜硫素得率的影響有顯著差異（P＜0.05），其中VC添加量0.7 mg/g 時(shí)極顯著，選取VC添加量0.4、0.7、1.0 mg/g 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 VC 添加量對(duì)蘿卜硫素得率的影響Fig.3 Effect of VC addition on extraction yield of sulforaphane

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

蘿卜硫素得率（Y）被認(rèn)為是自變量組合的響應(yīng)值，各自變量因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以由以下二次方程解釋：

式中，β0是偏移項(xiàng)，βi、βii和βij分別是線性、二次和交互回歸系數(shù)。

所有試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析均采用試用版軟件Design Expert（Version 12.0）進(jìn)行，以估計(jì)自變量的響應(yīng)值。應(yīng)用 Box-Behnken 建立了三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。用Design Expert 12.0 軟件擬合得到如下編碼值回歸方程：

表2 BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of BBD

方差分析結(jié)果如表3 所示。模型F=322.65（P＜0.001），表明該模型方程具有較高的精確度。失擬項(xiàng)通常用來表示所用的模型方程和實(shí)驗(yàn)的擬合程度，即二者差異的程度，而回歸模型的失擬項(xiàng)F=5.11（P＞0.05），說明失擬項(xiàng)誤差不顯著，該響應(yīng)面模型的誤差較小。模型的校正決定系數(shù)為R2adj=0.9945，決定系數(shù)R2=0.9976，表明該模型能較好地解釋響應(yīng)值的變化，該模型能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。總的來說，該模型方程可以較好地預(yù)測(cè)蘿卜硫素得率。一次項(xiàng)A、B、C 對(duì)得率均具有極顯著的影響（P＜0.01）。二次項(xiàng)（A2、B2、C2）及交互作用項(xiàng)（AB、AC、BC）均極顯著（P＜0.01）。各因素的影響順序?yàn)椋篈（酶解時(shí)間）＞C（VC添加量）＞B（酶解溫度）。

表3 蘿卜籽蘿卜硫素得率回歸分析Table 3 Regression analysis of sulforaphane yield of Raphanus sativus seeds

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖可以形象地反映工藝條件對(duì)響應(yīng)值影響的交互作用，一般響應(yīng)曲線越陡峭，因素的影響越顯著，而走勢(shì)越平滑，影響越小。由圖4 所示，得率曲線隨著各因素（酶解時(shí)間、酶解溫度、VC添加量）的變化規(guī)律相似，在這三個(gè)自變量取值接近0 編碼值時(shí)，得率值最大，但當(dāng)各因素水平超過0 編碼值時(shí)，得率反而降低。適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)酶解時(shí)間和提高酶解溫度，有利于蘿卜籽中的GLS 向蘿卜硫素的酶解和轉(zhuǎn)換，但過高的時(shí)間和溫度可能導(dǎo)致芥子酶的損失，不利于GLS 的酶解[24]。VC能保護(hù)生成的蘿卜硫素，避免其氧化損失，提高蘿卜硫素得率[25]。而過多的VC可能改變提取體系的pH，從而導(dǎo)致得率降低，其影響規(guī)律有待于進(jìn)一步研究。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the interactive effects of various factors

此外，各因素的響應(yīng)面圖顏色由綠變紅，顏色變化差異較大，且存在最高點(diǎn)。各等高線圖的中心區(qū)域均呈橢圓形，以上結(jié)果表明各因素對(duì)蘿卜硫素得率的影響存在顯著的交互作用。其中，酶解時(shí)間與其他兩個(gè)因素的響應(yīng)面圖中心區(qū)域呈現(xiàn)較為顯著的橢圓形，且交互項(xiàng)F值較高，表明交互作用較為明顯。郭彩慧等[26]研究發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用對(duì)西蘭花蘿卜硫素提取量的影響較大。其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步通過回歸分析得到蘿卜硫素的理論最佳酶解工藝條件為：酶解時(shí)間21.59 min、酶解溫度為39.39 ℃、VC添加量為0.809 mg/g，蘿卜硫素得率為2.14 mg/g。考慮到實(shí)踐操作的可行性，將實(shí)際提取條件調(diào)整為酶解時(shí)間22 min、酶解溫度40 ℃、VC添加量為0.8 mg/g。平行3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化工藝的真實(shí)性，得到實(shí)際蘿卜硫素得率為2.11±0.02 mg/g，與理論值接近，相對(duì)誤差為1.40%，說明優(yōu)化的酶解工藝準(zhǔn)確可靠，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

2.5 體外模擬胃腸消化中蘿卜硫素的變化

體外胃腸消化模型能反映生物活性物質(zhì)在人體胃腸道消化過程中的生物利用情況，被廣泛應(yīng)用于植物活性成分生物可及性研究[27]。本研究在最優(yōu)酶解條件下制備蘿卜籽乙酸乙酯提取物，并采用體外消化模擬模型評(píng)價(jià)了胃腸消化對(duì)提取物中蘿卜硫素含量的影響。結(jié)果如圖5A 所示，未消化的提取物中蘿卜硫素含量為1.85±0.02 mg/g，經(jīng)過體外消化實(shí)驗(yàn)后，不可溶殘?jiān)械奶}卜硫素含量約為0.4 mg/g，而胃腸消化液中蘿卜硫素的含量分別1.47±0.05 和1.41±0.03 mg/g，保留率分別為79.64%±1.58%、76.22%±2.17%，差異不顯著（P＞0.05）（圖5B）。胃消化液及腸消化液中的蘿卜硫素含量差異不顯著（P＞0.05）。腸消化液中蘿卜硫素一般容易被機(jī)體吸收或被腸道菌群利用，該結(jié)果表明蘿卜籽蘿卜硫素有較好的生物可及性。以往類似研究也表明西蘭花籽蘿卜硫素經(jīng)唾液及胃腸消化后，能有效到達(dá)腸道被腸道菌群利用，具有較好生物可及性[28]。此外，該結(jié)果還提示胃消化對(duì)提取物中蘿卜硫素的破壞較強(qiáng)，其可能原因與蘿卜硫素被胃酸及胃蛋白降解或轉(zhuǎn)化有關(guān)[29-30]。

圖5 蘿卜籽乙酸乙酯提取物在體外模擬胃腸消化中蘿卜硫素的變化Fig.5 Changes of sulforaphane in ethyl acetate extracts from Raphanus sativus seeds during different stages in vitro simulated digestion

2.6 體外模擬胃腸消化中抗氧化活性的變化

單一的抗氧化檢測(cè)方法無法充分評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性，一般使用多種抗氧化檢測(cè)方法共同解釋其抗氧化能力。因此，本研究采用體外胃腸消化模型，結(jié)合DPPH、ABTS+及OH 自由基清除實(shí)驗(yàn)綜合檢測(cè)了提取物在模擬消化過程中的抗氧化活性變化規(guī)律，結(jié)果見圖6 所示，未消化組中，ABTS+、DPPH、OH 三種自由基清除率分別為64.80%、44.46%及20.63%，提取物對(duì)這三種自由基均表現(xiàn)出有一定的清除作用。以往研究已經(jīng)證實(shí)了蘿卜硫素具有較強(qiáng)的自由基清除能力[31]，因此，推測(cè)蘿卜籽提取物的抗氧化活性與蘿卜硫素有關(guān)。在胃消化液中，這三種自由基清除率分別為54.25%、33.90%及15.07%，均顯著低于未消化組（P＜0.05），其中DPPH 自由基的清除率下降率最大，達(dá)到了23.75%。而在腸消化液中，三種自由基清除率分別降低至42.36%、32.70%及15.95%，與胃消化組比較，差異不顯著（P＞0.05）。胃腸消化過程中自由基清除率與蘿卜硫素含量的變化趨勢(shì)相符，進(jìn)一步提示提取物抗氧性的變化與蘿卜硫素有關(guān)。但以往有研究表明蘿卜籽提取物中含有包括蘿卜硫素在內(nèi)的多種抗氧化活性成分[32]，本研究蘿卜籽乙酸乙酯提取物中的蘿卜硫素含量?jī)H約為1.85 mg/g，是一種混合組分，其表現(xiàn)的抗氧化活性是該體系中所有組分綜合作用的結(jié)果，尚不能闡明其中具體的活性組分及其作用機(jī)制，因此有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析。

圖6 蘿卜籽乙酸乙酯提取物在體外模擬消化中DPPH、ABTS+和OH 自由基清除率變化Fig.6 DPPH,ABTS+ and OH free radical scavenging rate in ethyl acetate extracts from Raphanus sativus seeds during different stages in vitro simulated digestion

3 結(jié)論

制備蘿卜籽蘿卜硫素最優(yōu)酶解工藝：酶解時(shí)間22 min，酶解溫度40 ℃，VC添加量0.8 mg/g，在此最佳酶解條件下，蘿卜硫素得率為2.11±0.02 mg/g。得到的二次回歸模型擬合度高。蘿卜籽乙酸乙酯提取物中蘿卜硫素成分在胃腸消化過程中出現(xiàn)一定程度的降解或轉(zhuǎn)化，但仍有約80%的該成分得到了保留。胃液消化對(duì)蘿卜硫素的影響高于腸液消化。三種自由基（ABTS+、DPPH、OH 自由基）清除率在胃腸消化過程中的變化與蘿卜硫素含量變化規(guī)律一致。本研究探索了酶法制備蘿卜籽蘿卜硫素的最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，建立的模型方程能可靠預(yù)測(cè)蘿卜硫素得率。蘿卜籽蘿卜硫素提取物經(jīng)消化，蘿卜硫素釋放性較好，具有較好的生物可及性及抗氧化活性。本研究不僅對(duì)蘿卜硫素的實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)也為提高蘿卜籽經(jīng)濟(jì)附加值提供了一定的理論依據(jù)。

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