基于SSR標記的黃驊古貝殼堤瀕危酸棗獨特性分析

尚國麗 劉穎 劉孟軍 王玖瑞

摘 要：【目的】黃驊古貝殼堤自然保護區酸棗種質可作為篩選棗抗鹽堿砧木的重要資源，但已處于瀕危狀態。對這些酸棗種質的挖掘研究，可為其合理利用、保護提供參考依據。【方法】本研究以黃驊古貝殼堤36個酸棗類型和來自8個省份的棗屬57個種質為試材，采用SSR分子標記，通過遺傳多樣性和親緣關系分析，揭示貝殼堤酸棗的特殊性。【結果】20對SSR引物從93份材料共獲得138個等位基因，平均每個位點6.9個等位基因。聚類分析將93份材料可分為9類，I類包含了黃驊古貝殼堤酸棗全部36個基因型，多樣性值分別為Na=5.40， Ne=3.18， I=1.30。通過群體結構分析得到的9個亞種群與聚類結果相對應。在Q≥0.6、Q≥0.8和Q≥0.9時，黃驊古貝殼堤酸棗種群的基因型數分別占97.4%、92.1%和86.8%。黃驊古貝殼堤酸棗雖然表現出遺傳多樣性， 但它與其他居群遺傳成分交流較少。【結論】黃驊古貝殼堤的野生瀕危酸棗種質資源獨特，應加強保護和評價利用。

關鍵詞：黃驊古貝殼堤；酸棗；遺傳多樣性；群體結構

文章編號：2096-8108（2024）01-0042-08? 中圖分類號：S665.1中圖分類號? 文獻標識碼：A文獻標志碼

SSR Markers Reveal the Specialty of Endangered Sour Jujube at Huanghua Ancient Chenier

SHANG? Guoli1，LIU? Ying1，LIU? Mengjun2，WANG? Jiurui1*

（1.College of Forestry， Hebei Agricultural University， Baoding Hebei 071001， China;

2.Research Center of Chinese Jujube， Hebei Agricultural University， Baoding Hebei 071001， China）

Abstract：【Objective】Sour jujube germplasms at Huanghua ancient Chenier， a provincial nature reserve， are potential resources for Chinese jujube rootstock with resistance to saline-alkali， yet the germplasms are endangered. The research on these germplasms can provide references for its rational utilization and protection.【Methods】Thirty-six sour jujubes collected from Huanghua ancient chenier and 57 jujube accessions from 8 provinces were used as materials to analyze the genetic diversity and relationship by SSR molecular marker technique， in order to reveal the specialty of sour jujube germplasm resources at Huanghua ancient chenier. 【Results】The results showed that a total of 138 alleles with an average of 6.9 alleles per locus were obtained by 20 SSR primer pairs. The accessions were divided into nine main groups and cluster I contained all 36 sour jujube genotypes from Huanghua ancient chenier with diversity values （Na=5.40， Ne=3.18， I=1.30）. Nine subpopulations obtained by analysis of population structure corresponded to the cluster results. The number of genotypes accounted for 97.4%， 92.1% and 86.8% of Huanghua ancient chenier population at Q ≥ 0.6， Q ≥ 0.8 and Q ≥ 0.9， respectively. The sour jujube population of Huanghua ancient chenier showed genetic diversity， yet the exchange of genetic components between Huanghua ancient chenier population and other populations was relatively low. 【Conclusion】The wild and endangered sour jujube germplasms at Huanghua ancient chenier are distinctive resources and should be further conserved， evaluated and utilized.

Keywords：Huanghua ancient chenier; sour jujube; genetic diversity; population structure

酸棗（Ziziphus acidojujuba C. Y. Cheng et M. J. Liu）屬鼠李科棗屬植物，原產于中國，是中國栽培棗（Ziziphus jujuba Mill.）的祖先［1-2］。酸棗通常是灌木，稀為小喬木，廣泛分布于中國北方，是最受歡迎的野生水果和重要藥用植物之一［3-4］。其果實具有獨特的酸味，維生素C含量極高，具有重要的藥用和營養價值［5-6］。酸棗具有抗寒、抗旱、耐澇、耐鹽堿化、耐瘠薄等特點，常被用作山地造林的先鋒植物和栽培棗樹的優良砧木［7-8］。近年來，由于保護意識的缺乏和對酸棗種子的過度采收，造成了酸棗種質資源的部分流失。黃驊古貝殼堤是1998年經中國河北省人民政府批準設立的省級自然保護區，位于渤海灣西岸，其開發規模、時間跨度和地質信息在世界上都是罕見的［9-11］。酸棗是黃驊古貝殼堤中最具優勢的喬木植物，有著不可替代的防風固沙作用。黃驊古貝殼堤沿線的野生酸棗資源具有一定的抗鹽堿、抗寒、抗旱能力，然而它們的應用、開發和保護還不夠。黃驊古貝殼堤的酸棗作為野生資源，很少受到人們的重視，由于部分酸棗種植區已轉為耕地，原有的種質資源規模已遭受大量破壞。

不同類型的分子標記可用于品種鑒定、多樣性分析和系統發生研究等，如RAPD［12-13］、AFLP［14］、SRAP［15］和簡單重復序列（SSR或微衛星）［7，16-17］。其中SSR分子標記具有多態性高、可重復性好、孟德爾遺傳和共顯性等優點，通常在親緣種之間具有良好的保守性［18-19］。此外，它的PCR反應程序相對簡單，可應用低質量的DNA［20］。因此，SSR分子標記是研究酸棗資源的有效工具［21-22］。本研究利用SSR分子標記對收集到的黃驊古貝殼堤酸棗及其他種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，探討黃驊古貝殼堤瀕危酸棗種質資源的獨特性。

1 材料與方法

1.1 材料

在河北省黃驊古貝殼堤，選取有代表性的酸棗樣樹36株，采集葉片樣品。用保鮮袋封存后置于冰盒帶回河北農業大學中國棗研究中心分子實驗室，置于-20℃冰箱中保存，用于DNA提取。同時收集了41份來自6個省份的酸棗類型、13個主栽棗品種和3個毛葉棗（見表1）。

1.2 基因組DNA提取和SSR分析

采用CTAB法從嫩葉中提取基因組DNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，同時，在Nanodrop2000超微量核酸儀上進行DNA質量和濃度的檢測。本試驗采用肖京［23］設計的20對SSR引物（見表2）。聚合酶鏈反應（PCR）擴增采用12.5 μL的反應體系，其中0.5 μL 50 ng/μL基因組DNA模板，6.25 μL 2×Taq Master Mix （Tiangen），正向和反向引物各0.5 μL，用ddH2O補足體積。擴增程序為94 ℃預變性3 min，然后在94 ℃下變性30 s， 50～60℃退火反應30 s， 72 ℃延伸30 s，共28個循環，最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。點3 μL PCR產物于8%變性聚丙烯酰胺凝膠上，置于1倍TBE緩沖液中，恒壓200 V電泳50 min，銀染顯色后拍照記錄。

1.3 遺傳多樣性分析

將原始0，1數據轉換成AB數據，利用POPGENE 32軟件分析遺傳多樣性，包括等位基因數目（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shonnons信息指數（I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、近交系數（Fis， Fit， Fst）、Neis多樣性指數（H）、Neis遺傳距離（D）、遺傳一致度（I）等的計算。

原始數據經NTSYS-2.10軟件處理，Qualitative data程序計算相似系數（GS），獲得相似系數矩陣后，用SAHN程序中UPGMA（非加權配對算術）方法進行聚類分析，并通過Tree Plot模塊生成聚類圖繪制UPGMA親緣關系樹狀圖，分析遺傳距離和種質關系。

1.4 群體結構分析

利用Structure 2.3.4軟件［24］分析居群結構，用混合模型（Admixture Model）和等位變異發生頻率相關模型（Allele Frequencies Correlated）進行群體遺傳結構分析，其中貝葉斯聚類過程中的兩個基本參數Length of burnin period和Number of MCMC Reps after Burnin分別設置為10 000和100 000，K值設置為1～15，運行40次。根據Evanno［25］運算ΔK，最優K值為第一個ΔK峰值。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多態性

20對SSR引物在93個樣品中共檢測到138個等位基因，平均每個位點6.9個等位基因。每對引物多態性譜帶的百分率是100%，擴增片段范圍為100～290 bp。不同的引物擴增出的等位基因數量也不盡相同。擴增出等位基因數量最多的是JSSR485，共計14個；相對最少的是JSSR285，是4個（見表3）。觀測雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.59和0.76，變幅分別為0.27～0.84 和0.61～0.88。香農指數的變化范圍是1.20（JSSR445）和2.26（JSSR485），平均為1.60。基因流的變化范圍是0.25（JSSR195）和1.11（JSSR490），平均為0.58。PIC的分布范圍在0.58～0.87，分別在JSSR445和JSSR485，平均為0.73。篩選出的20對引物的PIC值全部大于0.5，表明全部為高度多態性引物，能較高信息量的反應出試材基因型多樣性水平。

2.2 遺傳多樣性分析

在聚類閾值為0.72的情況下，將93個樣品劃分為9個主要類群（見圖1）。第I大類包含黃驊古貝殼堤的全部 36 份酸棗樣品和河北邢臺的4份酸棗樣品。第II大類和第III大類均為河北省酸棗，每個亞群分別有4個和7個酸棗類型。第Ⅳ大類包含3個酸棗類型，其中2個來自河北省，1個來自山西省。第Ⅴ大類組成較復雜，包含13個主栽的中國棗品種、7個河北省的酸棗類型、3個遼寧的酸棗類型、2個河南的酸棗類型、1個山西的酸棗類型和1個山東的酸棗類型。第Ⅵ大類由3個酸棗類型組成，其中1個來自山東省，剩余2個來自山西省。第Ⅶ大類包含4個酸棗類型，2個來自河南，2個來自陜西。第Ⅷ由2個酸棗類型組成，并且全部來自山東省。第Ⅸ大類由3個來自云南的毛葉棗組成。

為了闡明各大類群間的遺傳分化，同時計算了Neis遺傳距離與遺傳一致度。由表4可知，遺傳一致度的變幅為0.0979～0.6962，相應的遺傳距離變幅為0.3621～2.3241。第Ⅲ大類和第Ⅴ大類最近，遺傳一致度為0.6962，同時遺傳距離最小為0.3621。第Ⅷ大類和第Ⅸ大類最遠，其遺傳一致度最低為0.0979，遺傳距離最大為2.2341。包括所有貝殼堤樣品在內的第I大類與第Ⅲ大類最近，其遺傳一致度為0.6539，遺傳距離為0.4247。很明顯，第I大類與包含3個毛葉棗品種‘高朗‘脆密‘蜜絲在內的第Ⅸ大類最遠，其遺傳一致度為0.2407，遺傳距離為1.4243。

分析了反映各大類群間的遺傳多樣性的指標，包括每個類群的觀測到等位基因數量（Na）、有效等位基因數量（Ne）、香農指數（I）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和固定指數（F）。由表5可知，9

大類群的香農指數（I）的變化范圍是0.46～1.36，平均為1.02。觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）的變化范圍分別為0.50～0.68和0.36～0.71，均值分別為0.61和0.64。大多數位點的期望雜合度高于觀測雜合度。固定指數（F）的變化范圍是0.4043～0.8055，平均為 0.4860。第Ⅴ大類遺傳多樣性最豐富（Na= 5.55、Ne= 3.47、I= 1.36）。其次就是包含 36 個黃驊古貝殼堤酸棗類型的第Ⅰ大類（Na=5.40、Ne=3.18、I = 1.30）。聚類Ⅸ多樣性最低（Na=1.86， Ne=2.69， I=0.46）。

2.3 群體結構分析

根據20個SSR標記的基因分型數據對群體結構進行分析（見圖2）。根據模型統計表明，在K=9時，ΔK=3.75，顯著高于其他處峰值，將樣品劃分為9個群體，依次進行編號（A～I）。與本研究的距離聚類相一致的是，包含36個黃驊古貝殼堤酸棗類型的群體 E 極少有與其他8個群體的相互混雜成分。

縱坐標表示各群體中的每個個體占某群體祖先成分系數（Q）;橫坐標的數字表示每個個體的編號，與表1中第一列的編號一致另外，一些群體（如A、B群體）中遺傳背景比較一致，全部來源于河北省，混雜程度相對較低；而有的群體（如H、I群體）中分配率較高，個體間混合程度相對較高，來源于不同的栽培區域，群體間的遺傳物質交流相對較多。

Q值可以反映各樣品所含不同類群遺傳成分的多少（見表6）。群體B、C中Q≥0.6是100%，全部是來自河北省的酸棗類型，沒有其他類群的遺傳成分。其次就是黃驊古貝殼堤群體（E）Q≥0.6是97.4%，Q值大于0.8和0.9的樣品占92.1%和86.8%，說明黃驊古貝殼堤群體中基本沒有含有其他類群的遺傳成分。

3 討論與結論

聚類分析可以反映親緣關系的遠近。本研究第Ⅴ大類中，13個主栽棗品種與14個酸棗聚在一起，即酸棗與棗沒有完全分開，其他亞組中則沒有酸棗和棗聚在一起的現象，說明棗和酸棗親緣關系近，這與李瑞環等［12］的結果一致。所有黃驊古貝殼堤酸棗都聚集在第Ⅰ大類，而作為外對照，其他6個省的

酸棗類型并沒有根據地理位置的不同而區分開來，只有貝殼堤酸棗能很好的和外對照酸棗、主栽棗品種以及毛葉棗區分開。因此，不能簡單根據地理位置劃分組別，而貝殼堤酸棗較為獨特。毛葉棗種質可以單獨聚類到一起，與其他的遺傳相似系數為0.67，說明毛葉棗跟酸棗和棗的親緣關系較遠［26］。

高的雜合度意味著高的遺傳多樣性［27-28］。本試驗中，黃驊古貝殼堤酸棗群體的觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.56和0.68。同樣利用SSR標記，在酸棗上報道過更高水平的多態性（Ho=0.812，He=0.805［29］。相對于其他地區，黃驊古貝殼堤酸棗遺傳多樣性低，可能是由于地理位置特殊，相對閉塞，與外地的酸棗種質基因交流少的結果。

群體結構分析是關聯分析的重要步驟，可有效避免錯誤的相似性或偽造關聯性，從而可以更有效的對自然群體做關聯分析［24，30］。本研究只有黃驊古貝殼堤群體（E）、云南毛葉棗群體（C）和大部分遼寧酸棗群體（F）可很明顯的獨立成一個群體，而其他地區酸棗則被劃分到不同的群體或有一部分與其他地區樣品結合。例如樣品數量僅次于黃驊古貝殼堤酸棗的河北省酸棗群體分布在A、B、D、I 4個群體中，這表明任何來自同一地理區域內的酸棗材料都存在多種血緣來源或較多的遺傳變異類型。I組中包括河北、河南、山西、陜西四地的酸棗，這種結果可能是由于酸棗的多點起源且相互交流所導致的。盡管酸棗的群體結構和遷徙情況很復雜，但黃驊古貝殼堤酸棗仍然自己聚在一起，原因可能是黃驊古貝殼堤酸棗極其特殊的地理位置和生長環境，導致古貝殼堤酸棗較為封閉，交流少。此外，Q值反映各自交系所含不同類群遺傳成分的比例［31］。本研究解析93個樣品遺傳成分發現，93個樣品中有 18.3% （17個）的最大Q值小于0.6，說明有少量樣品融合了多個類群的遺傳成分，在黃驊古貝殼堤群體（E）中，36個來自黃驊古貝殼堤的樣品最大Q值全部大于0.6。由此可見，貝殼堤酸棗幾乎沒有跨類群的遺傳成分。處于瀕危的黃驊古貝殼堤酸棗資源獨特，應進一步加強保護利用。

中文致謝

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收稿日期：2023-11-06中文收稿日期

基金項目：河北省重點研發計劃項目（21326304D-1）。

第一作者簡介：尚國麗（1998-），女，在讀碩士，主要從事棗屬植物發掘利用研究。E-mail：sgl15224701115@163.com

通信作者：王玖瑞（1972-），男，博士，教授，主要從事棗屬植物發掘利用等研究。E-mail：wjrjujube@126.com