玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配及其致病性分析

摘要： 為驗證玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現象可以明確不同交配型菌株的可行性，運用稀釋純化法分離純化玉米黑粉菌單倍體菌株10個，將單倍體菌株兩兩混合后，運用劃線法在固體培養基YPDA上培養7 d，選取菌落表面形成白色菌絲、鏡檢明確平板交配的菌株。通過注射接種玉米植株幼苗，分析各菌株組合對玉米植株的致病性。結果表明，在45組菌株組合中出現平板交配現象的菌株組合有9種，因與同一單倍體菌株產生平板交配現象的菌株為相同交配型菌株，由此可知3號菌株、5號菌株、8號菌株及9號菌株為相同交配型菌株；1號菌株、4號菌株、6號菌株、7號菌株及10號菌株為相同交配型菌株。通過玉米侵染試驗發現，在45組菌株組合中有26種組合可以引起玉米植株腫瘤，26種組合中每組中的2個單倍體菌株為不同型單倍體菌株，進而明確2號菌株、3號菌株、5號菌株、8號菌株及9號菌株為相同交配型菌株；1號菌株、4號菌株、6號菌株、7號菌株及10號菌株為相同交配型菌株。除2號菌株外，通過平板交配現象推導結果與玉米侵染試驗獲得的結果完全一致。本研究表明通過玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現象可以進行菌株的不同交配型鑒定。

關鍵詞： 玉米黑粉菌；平板交配；交配型鑒定；致病性

中圖分類號：S435.131.4+1 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0123-05

玉米黑粉菌（Ustilago maydis）屬黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌科（Ustilaginaceae），可以侵染玉米植株的所有地上組織，并迅速引起玉米植物組織膨大，造成玉米植株特異性生長，并最終在玉米地上組織形成黑粉瘤［1-2］。U. maydis的整個生活史包含腐生生活的酵母型和寄生生活的菌絲型2種型態，由酵母型向菌絲型的轉化是U. maydis成功侵染寄主植物的關鍵［3-5］。U. maydis侵染玉米植物組織的典型癥狀是誘導植物地上部分各類組織膨大形成含有黑色冬孢子的植物腫瘤［6-7］。當膨大的植物組織破裂后，黑色冬孢子也會隨之被釋放，隨風和水流擴散，在遇到合適條件后萌發，重新形成酵母型單倍體細胞［8］。

雖然黑粉菌的有性生殖需要寄主，但在人工培養基上也能獲得快速生長。玉米黑粉菌的生命周期可分為單倍體孢子和雙核菌絲體2個階段［9-10］。單倍體孢子可在特定的培養基上芽殖，菌體形態類似酵母狀，但這種形式的單倍體孢子不具有致病力。只有當2個不同交配型的單倍體孢子通過a雙等位基因座編碼的信息素-受體體系相互識別并發生單倍體細胞間的融合形成雙核菌絲體后，b多等位基因座的bE/bW（ bEast/bWest） 異源二聚體觸發包括多個轉錄因子基因和38個潛在效應基因在內的調控級聯，從而調控雙核菌絲的維持、致病性及有性生殖的完成［11-13］。只有2個不同交配型的單倍體菌株交配結合形成雙核菌絲體，才能形成玉米黑粉病的典型癥狀，因此篩選不同交配型的單倍體菌株對玉米黑粉菌與玉米互作研究至關重要。

最早在1932年的Sleumer以及之后的Bowman（1946）、Rowell（1955）均認為2個不同交配型的單倍體的交配反應可以在人工培養基上進行，他們在顯微鏡下觀察到了親和的單倍體細胞的融合，然而，這個融合產物沒有進一步的發展，未形成冬孢子［14-16］。也是在1932年，Bauch報道了顯微鏡下的交配跡象［17］。在麥芽培養基上，2個親和菌株的單菌落疊加在一起，便可以在菌落表面形成一層厚重的菌絲；非親和的2個單倍體菌株保持著酵母狀生長，并保持著正常的人工培養基上的生長模式。同時Bauch把這一現象叫作平板交配［17］。在本研究中，將獲得的2個單倍體菌株混合后在固體培養基YPDA上培養，出現了平板交配的現象，且國內未見報道。本研究發現出現平板交配現象的2個單倍體一定為不同型單倍體菌株。同時本研究對出現和未出現平板交配的2個單倍體菌株進行玉米致病性分析，從而明確菌株的不同交配型，驗證了通過平板交配現象篩選菌株的不同交配型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米黑粉菌菌瘤于2020年8月分別從吉林省雙陽、公主嶺2個地點采集，所采集樣品由吉林省農業科學院植物保護研究所微生物重點實驗室保存。

1.2 樣品處理

將田間采集的玉米黑粉菌菌瘤用70%無水乙醇進行表面消毒2次，每次3 min。在超凈工作臺內用無菌牙簽刺入菌瘤內，挑取少量菌粉置于3 mL含有Amp抗生素的 YEPS液體培養基中過夜培養。取接近試管底部的1.5 mL過夜培養液于2 mL離心管內進行菌體收集，倒掉上清，取沉淀進行冬孢子萌發觀察。

1.3 單胞分離

根據上述冬孢子的萌發情況，采用稀釋純化法［18］分離純化單倍體菌株。準備適量潔凈的硬瓊脂膠培養基（瓊脂占比為3%），倒在培養皿中，待凝固后在培養皿的背面用記號筆畫4～5 mm的小格；接著將菌體沉淀用1 mL無菌水回溶鏡檢觀察其孢子濃度，直至稀釋至1個視野內擔孢子的個數在30個左右時，用無菌牙簽蘸取濃度適當的孢子懸浮液，移在瓊脂平板表面上所畫的小格范圍內，稍向下壓，使培養基表面稍微下凹，但勿使表面破碎。而后，從培養皿的背面，用低倍鏡檢視小格內孢子數目，如格內只有1個孢子，就用無菌接種鏟將這一小塊培養皿取下，移植在YPDA培養基內培養。待形成菌落后再進行劃線取單菌落搖菌進行菌種保存。分別從雙陽、公主嶺2個地點的玉米黑粉菌菌瘤內獲得10株單倍體菌株。

1.4 單倍體菌株的平板交配

將獲得的10株單倍體菌株進行搖菌過夜培養，按照表1方式選取2個單倍體菌株培養液按1 ∶ 1的比例混合，并收集菌體，用無菌牙簽蘸取沉淀進行劃線培養。于28 ℃的培養箱內培養，劃線培養基為YPDA。待菌落長出后，進行顯微鏡觀察，約7 d后，菌落平板表面長出透明菌絲或者白色菌絲，再次進行顯微鏡觀察。

1.5 不同菌株組合致病性分析

將獲得的10株單倍體菌株進行搖菌過夜培養，菌液D 600 nm為2.0時，按照表1方式選取2個單倍體菌株再次按1 ∶ 1的比例混合，收集菌體，并用無菌水進行回溶，D 600 nm為2.0，注射接種玉米植株幼苗，觀察發病情況并記錄。

2 結果與分析

2.1 顯微鏡觀察

經無菌牙簽刺入菌瘤內取菌粉過夜培養后，取沉淀進行顯微鏡觀察時發現此時冬孢子萌發形成擔子及擔孢子（圖1）。

2.2 單倍體菌株的平板交配

將經單胞分離獲得的單倍體菌株兩兩混合進行搖菌，收集菌體進行劃線培養。待菌落長出后，進行顯微鏡觀察發現，有的擔孢子出現分隔并伸長（圖2），而有的擔孢子則未出現分隔（圖3）；培養 7 d 后，可見平板內菌落表面有的形成白色菌絲（圖4），有的未形成白色菌絲，此時鏡檢發現菌絲，同時分隔的擔孢子形成芽管（圖5），芽管結合形成菌絲，出現平板交配現象（圖6）。當2個單倍體出現平板交配現象時，說明2個單倍體是親和的，屬于真正意義上的細胞融合，因此這種互作叫作平板交配［11］。鏡檢發現有的菌絲有分隔（圖7），有的菌絲沒有分隔（圖8），均未觀察到鎖狀聯合。

各菌株與其他菌株的45種組合中有9種組合觀察到平板交配現象（表2），1號菌株與5號菌株、8號菌株；3號菌株與7號菌株、10號菌株；4號菌株與5號菌株、8號菌株；5號菌株與1號菌株、4號菌株、10號菌株；6號菌與8號菌株、9號菌株；7號菌株與3號菌株；8號菌株與1號菌株、4號菌株、6號菌株；9號菌株與6號菌株；10號菌株與3號菌株、5號菌株。而2號菌株和其他菌株未出現平板交配現象。

從菌株交配型關系可以推斷，3號菌株、5號菌株、8號菌株及9號菌株為相同交配型菌株；1號菌株、4號菌株、6號菌株、7號菌株及10號菌株為相同交配型菌株。

2.3 不同菌株組合致病性分析

將不同組合的菌株注射接種玉米植株幼苗，分析各菌株組合致病性（圖9）。通常接種后 3 d 出現褪綠病斑，6 d出現腫瘤。各菌株與其他菌株的45種組合中有26種組合可以引起玉米葉片腫瘤（表3）。筆者發現出現平板交配的組合菌株，在玉米植株內一定會發生交配，并在玉米葉片上形成腫瘤，即這2個單倍體菌株為不同型的單倍體菌株；但未出現平板交配現象的組合菌株，在玉米植株內可能出現交配現象，在玉米葉片上形成腫瘤（表3）。由表3可知，2號菌株、3號菌株、5號菌株、8號菌株及9號菌株為相同交配型菌株，1號菌株、4號菌株、6號菌株、7號菌株及10號菌株為相同交配型菌株，與平板交配結果基本一致。

3 討論與結論

本研究取玉米黑粉菌的菌包內菌粉培養，并進行單胞分離獲得單倍體菌株，兩兩組合培養，出現平板交配的現象，該結果與Sleumer等的研究結果［14-16］一致。同時，平板交配現象的出現也說明玉蜀黍黑粉菌的交配能夠發生于體外。冬孢子萌發形成擔孢子，2個相互兼容的擔孢子相遇后停止芽殖，細胞形成相向的結合管；單倍體細胞融合后，U. maydis的細胞周期受到阻滯，形成具有侵染能力的雙核的菌絲型；不斷延伸的雙核菌絲遇到植物表面合適位置后在末端膨大形成附著胞，幫助雙核菌絲穿透植物表皮；穿透植物表皮后雙核菌絲進一步在植物細胞間延伸并大量增殖，引起植物組織膨大。侵染晚期，植物營養逐漸被消耗，膨大組織內的部分雙核菌絲開始出現核融合現象，形成雙倍體菌絲。雙倍體菌絲斷裂、聚合后分化形成冬孢子，冬孢子在植物組織破裂后被釋放。冬孢子遇到合適條件后又開始萌發，首先經減數分裂形成先菌絲，然后先菌絲經有絲分裂形成酵母型單倍體擔孢子［19］。

本研究平板交配現象是在菌落長出后約7 d，平板內菌落表面長出透明菌絲或者白色菌絲時觀察到的平板交配。張修軍等研究表明，擔抱子向菌絲形態轉化的決定因素是水分，即在環境變干、水分逐漸喪失的過程中轉變為菌絲形態［20］。本研究結果與之相一致，培養7 d的平板內培養基水分逐漸消失，平板內環境變干，擔孢子完成了向菌絲形態的轉化，故此平板內菌落表面長出透明菌絲或者白色菌絲。由于平板交配現象的出現說明玉蜀黍黑粉菌的交配能夠發生于體外，因此本研究推測玉米黑粉菌侵入玉米植株存在2種侵染方式，一種為冬孢子萌發形成擔孢子，當2個相互兼容的擔孢子相遇后停止芽殖，細胞形成相向的結合管，單倍體細胞融合后形成具有侵染能力的雙核菌絲，雙核菌絲侵入玉米植株；另外一種為冬孢子萌發形成擔孢子，擔孢子萌發形成單核菌絲，單核菌絲侵入玉米植株，玉米植株內的單核菌絲交配形成雙核菌絲，雙核菌絲進一步在植物細胞間延伸并大量增殖，引起植物組織膨大，形成腫瘤。同時本研究發現，平板交配獲得的同型單倍體菌株與玉米植株侵染試驗獲得的同型交配菌株結果基本一致。出現平板交配的2個單倍體菌株，在玉米植株內一定發生交配現象，并在葉片形成腫瘤，2個單倍體菌株為不同型單倍體菌株；而未出現平板交配的2個單倍體菌株，部分組合菌株會在玉米植株內發生交配現象，在葉片上形成腫瘤。也就是說能夠進行平板交配的一對菌株一定能夠在玉米植株上形成腫瘤。該現象與Puhalla的研究結果［21］相一致，盡管不能確定平板交配與在玉米植株內的真實交配的關系，但平板交配可以作為一種遺傳工具，便于統計交配類型，并且節省時間和人力，同時，平板交配也可以用于研究不相容位點的基因研究中。Puhalla在研究中發現，在培養基內加入0.5%的酪蛋白水解物或者均等氨基酸混合物會增加平板交配出現的頻率［21］。但在本研究中未加入該氨基酸，培養基為普通的固體培養基YPDA。因此若想快速獲得玉米黑粉菌不同型單倍體菌株可以在固體培養基內加入0.5%的酪蛋白水解物，增加平板交配現象的頻率，進而獲得不同交配型的單倍體菌株。

綜上所述，本研究可得出如下結論：取玉米黑粉菌的菌包內菌粉培養，并進行單胞分離獲得單倍體菌株，兩兩組合培養，采用普通的固體培養基YPDA培養，出現平板交配的現象。出現平板交配現象的2個單倍體一定為不同型單倍體菌株。玉米植株接種試驗表明，出現平板交配現象的菌株可以引起玉米葉片腫瘤，而部分未出現平板交配現象的單倍體菌株組合也可使玉米葉片形成腫瘤，說明這2個單倍體菌株為不同型單倍體菌株。平板交配現象可以明確2個不同單倍體菌株為不同型單倍體菌株，但對于不存在平板交配型的菌株只能通過接種玉米植株才能夠確定他們是否為不同型單倍體菌株。本研究表明，通過玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現象可以進行菌株的不同交配型鑒定。

參考文獻：

［1］ Ferris A C，Walbot V. Understanding Ustilago maydis infection of multiple maize organs［J］. Journal of Fungi，2020，7（1）：8.

［2］Kamper J，Kahmann R，Blker M，et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis［J］. Nature，2006，444（7115）：97-101.

［3］Castanheira S，Mielnichuk N，Pérez-Martín J. Programmed cell cycle arrest is required for infection of corn plants by the fungus Ustilago maydis［J］. Development，2014，141（24）：4817-4826.

［4］Castanheira S，Pérez-Martín J. Appressorium formation in the corn smut fungus Ustilago maydis requires a G2 cell cycle arrest［J］. Plant Signaling amp; Behavior，2015，10（4）：e1001227.

［5］Lanver D，Berndt P，Tollot M，et al. Plant surface cues prime Ustilago maydis for biotrophic development［J］. PLoS Pathogens，2014，10（7）：e1004272.

［6］Tanaka S，Brefort T，Neidig N，et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize［J］. eLife，2014，3：e01355.

［7］Banuett F，Herskowitz I. Discrete developmental stages during teliospore formation in "the corn smut fungus，Ustilago maydis［J］. Development，1996，122（10）：2965-2976.

［8］León-Ramírez C G，Cabrera-Ponce J L，Martínez-Espinoza A D，et al. Infection of alternative host plant species by Ustilago maydis［J］. New Phytologist，2004，164（2）：337-346.

［9］李智敏，嚴 理，嚴 準. 玉米瘤黑粉菌的寄生策略及其調控機制［J］. 微生物學報，2016，56（9）：1385-1397.

［10］ 陳三鳳，劉德虎，李季倫. 玉米瘤黑粉菌的遺傳交配型［J］. 微生物學通報，2000，27（2）：146-148.

［11］Kahmann R，Schirawski J.Mating in the smut fungi：fromatobto the downstream cascades［M］//Sex in fungi. Washington D C，USA：ASM Press，2014：377-387.

［12］Heimel K，Scherer M，Vranes M，et al. The transcription factor Rbf1 is the master regulator for b-mating type controlled pathogenic

development in Ustilago maydi［J］. PLoS Pathogens，2010，6（8）：e1001035.

［13］羅 西，劉蔣瓊，張申申，等. 玉米黑粉菌致病的分子機制研究進展［J］. 植物科學學報，2020，38（6）：853-861.

［14］Sleumer H O. Uber sexualitiit and zytologie von Ustilago zeae （Bechm.）［J］. Ungar Z Botan，1932，25：209-263.

［15］Bowman D H. Sporidial fusion in Ustilago maydis［J］. Agr Res，1946，72：233-243.

［16］Rowell J.Functional role of compatibility factors and an in vitro test for sexual compatibility with haploid lines of Ustilago zeae［J］. Phytopathology，1955，45：370-374.

［17］Bauch R. Die sexualitat von Ustilago scorzonereae and Ustilago zeae［J］. Phytopathol Z，1932，5：315-321.

［18］方中達. 植病研究方法［M］. 3版.北京：中國農業出版社，1998：130-138.

［19］夏文強，高麗丹，張雅芬，等. 玉米黑粉菌效應因子研究進展［J］. 農業生物技術學報，2021，29（11）：2232-2247.

［20］張修軍，Cooper R M. 玉蜀黍黑粉菌擔孢子萌發及侵染過程的研究［J］. 湖北農學院學報，1993（3）：189-193.

［21］Puhalla J E.Compatibility reactions on solid medium and interstrain inhibition in Ustilago maydis［J］. Genetics，1968，60（3）：461-474.

收 稿日期：2023-02-20

基金項目：吉林省農業科學院基本科研經費項目（編號：KYJF2021ZR105）；吉林省科技廳中央引導地方科技發展資金（編號：202002064JC）。

作者簡介：鄒曉威（1983—），女，吉林松原人，碩士，副研究員，從事玉米真菌病害研究，E-mail：zouxiaowei2008@126.com；共同第一作者：夏 蕾（1982—），女，吉林松原人，博士，副研究員，從事微生物研究，E-mail：fushun1020@yeah.net。

通信作者：鄭 巖，博士，研究員，從事玉米真菌病害研究，E-mail：jlzhengyan@163.com。