消脂合劑調節PI3K/Akt/mTOR信號通路對肥胖小鼠糖脂代謝的影響

[摘要]"目的"探討消脂合劑調節磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路對肥胖小鼠糖脂代謝的影響。方法"將造模成功的肥胖小鼠50只隨機分為5組，即模型組（蒸餾水）、低劑量組（3.5ml/kg消脂合劑）、中劑量組（7ml/kg消脂合劑）、高劑量組（14ml/kg消脂合劑）、陽性藥組（30mg/kg吡格列），每組各10只；未經高脂造模的小鼠10只納入正常組（蒸餾水），干預6周。觀察各組小鼠干預后的Lee’s指數、體質量、腹圍、糖脂代謝水平[空腹血糖（fasting"blood"glucose，FBG）、空腹胰島素（fasting"insulin，FINS）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total"cholesterol，TC）、游離脂肪酸（free"fatty"acids，FFA）]、肝臟組織病理學，檢測各組織中過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome"proliferator-activated"receptor，PPARγ）、mTOR、PI3K、Akt蛋白及mRNA表達。結果"與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低小鼠的Lee’s指數、體質量、腹圍、FBG、FINS、TC、TG、FFA（Plt;0.05）；陽性藥組具有相同作用（Plt;0.05）。肝臟組織病理結果顯示，與模型組比較，各給藥組小鼠肝細胞脂肪變性和空泡化明顯減少。與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性升高PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的蛋白和mRNA表達水平（Plt;0.05），陽性藥組具有相同作用（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05）。結論"消脂合劑可調節肥胖小鼠的糖脂代謝，呈劑量遞增效果，其機制可能與調節PI3K/Akt/mTOR信號通路上調PPARγ水平有關。

[關鍵詞]"肥胖；消脂合劑；PPARγ；PI3K/Akt/mTOR信號通路

[中圖分類號]"R589""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.07.017

Xiaozhi"mixture"regulates"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway"on"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice

CHEN"Lujia，"LIU"Hongfei，"DENG"Yanhua，"ZHOU"Jianyang

Department"of"Zhiweibing，Ningbo"Hospital"of"TCM"Affiliated"to"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Ningbo"315010，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effects"of"Xiaozhi"mixture"on"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice"by"regulating"phosphoinositide"3-kinase"（PI3K）/"protein"kinase"B"（Akt）/"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"signaling"pathway."Methods"Fifty"obese"mice"with"successful"modeling"were"randomly"divided"into"five"groups："model"group"（distilled"water），"low-dose"group"（3.5ml/kg"Xiaozhi"mixture），"medium-dose"group"（7ml/kg"Xiaozhi"mixture），"high-dose"group"（14ml/kg"Xiaozhi"mixture）"and"positive"drug"group"（30mg/kg"pioglitazone），"with"10"mice"in"each"group."Ten"mice"without"high"fat"modeling"were"included"in"normal"group"（distilled"water）."All"groups"were"intervened"for"6"weeks."Lee’s"index，"body"weight，"abdominal"circumference，"glucose"and"lipid"metabolism"level"[fasting"blood"glucose"（FBG），"fasting"insulin"（FINS），"triglyceride"（TG），"total"cholesterol，"（TC），"free"fatty"acids"（FFA）]，"liver"histopathology"of"each"group"of"mice"after"intervention"were"observed，"and"mRNA"and"protein"expression"of"peroxisome"proliferator-activated"receptor"（PPARγ），"mTOR，"PI3K，"Akt"in"each"tissue"were"detected."Results"Compared"with"model"group，"Xiaozhi"mixture"decreased"Lee’s"index，"body"weight，"abdominal"circumference，"FBG，"FINS，"TC，"TG"and"FFA"in"a"dose-dependent"manner"（Plt;0.05），"and"positive"drug"group"had"the"same"effects"（Plt;0.05）."The"histopathological"results"of"liver"showed"that"compared"with"the"model"group，"the"steatosis"and"vacuolation"of"hepatocytes"in"each"administration"group"were"significantly"reduced."Compared"with"model"group，"Xiaozhi"mixture"increased"the"protein"and"mRNA"expression"levels"of"PPARγ，"mTOR，"PI3K"and"Akt"in"a"dose-dependent"manner"（Plt;0.05），"and"positive"drug"group"had"the"same"effect"（Plt;0.05）."Among"the"dose"groups"of"Xiaozhi"mixture，"high-dose"group"had"the"best"effect，"and"low-dose"group"had"the"least"effect"（Plt;0.05）."Conclusion"Xiaozhi"mixture"can"regulate"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice"in"a"dose-increasing"manner，"and"the"mechanism"may"be"related"to"regulating"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway"to"up-regulate"PPARγ"levels.

[Key"words]"Obesity;"Xiaozhi"mixture;"PPARγ;"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway

研究表明，肥胖與代謝性疾病的發生密切相關，尤其是腹型肥胖，可導致高血壓、糖尿病、高脂血癥、動脈硬化、嚴重心血管事件的發生及惡化。肥胖癥的發生由機體能量代謝失衡所引起，過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome"proliferator-activated"receptor，PPARγ）是脂肪生成和脂肪組織發育過程中的一個關鍵調控因子，在糖脂代謝、胰島素敏感性、動脈粥樣硬化、炎癥反應和免疫反應等多種生物學過程中發揮重要作用[1]。本課題組前期研究發現，消脂合劑可改善患者的體質量及糖脂代謝指標，并通過動物實驗發現其對胰島素敏感性等有較好的干預效果。為深入探討消脂合劑干預肥胖癥糖脂代謝的作用機制，本研究以PPARγ為切入點，通過闡明其與磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路的關系，為消脂合劑更好地應用于臨床治療肥胖癥提供實驗依據。

1""材料與方法

1.1""實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠80只，體質量（20±2）g，由杭州醫學院提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002。小鼠飼養于浙江省中醫藥研究院實驗動物中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12h晝夜節律飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0010。

1.2nbsp;"藥物與試劑

消脂合劑組方：生黃芪30g、葛根30g、蒼術20g、絞股藍20g、薏苡仁30g、茯苓20g、紅景天20g、紅曲10g、荷葉10g。將消脂合劑全方藥材粉碎成粗粉，8倍水煎煮2次，每次1h，合并濾液，調整pH值至中性，濃縮定容至1L，制成生藥濃度4g/ml的濃縮液，–20℃保存備用，由寧波市中醫院提供。鹽酸吡格列片，國藥準字H20050500，杭州中美華東制藥有限公司生產。

1.3""動物分組及模型制備

1.3.1""模型制備""常規飼料適應性喂養2周后分組，小鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（70只）。造模組小鼠予45%高脂飼料喂養（35%碳水化合物，20%蛋白質和45%脂肪），持續12周。12周后，篩選出50只作為成模小鼠（體質量gt;正常組平均體質量+2SD，且Lee’s指數顯著高于正常組定義為肥胖小鼠）。

1.3.2""分組和給藥""將造模成功的肥胖小鼠50只隨機分為5組，即模型組、低劑量組（3.5ml/kg消脂合劑）、中劑量組（7ml/kg消脂合劑）、高劑量組（14ml/kg消脂合劑）、陽性藥組（30mg/ml吡格列酮），每組10只，3個藥物組小鼠分別給予相應劑量的消脂合劑灌胃，陽性藥組小鼠予10ml吡格列水溶液灌胃。模型組和正常組小鼠予蒸餾水10ml/kg灌胃。6組小鼠每日早8：00給藥1次，連續給藥6周，每周稱重。正常組以普通飼料喂養，其他組仍以高脂飼料喂養。

1.4""檢測指標

1.4.1""實驗動物行為及體征觀察""觀察實驗小鼠的活動、進食、精神狀態，稱量造模后各組小鼠的體質量及給藥6周后體質量、腹圍，并計算給藥6周后Lee’s指數[Lee’s指數=（末次體質量×1000）×1/3體長]、飼料消耗量。

1.4.2""各組小鼠糖脂代謝水平""給藥6周后各組小鼠均斷頭采血測定空腹血糖（fasting"blood"glucose，FBG）、空腹胰島素（fasting"insulin，FINS）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total"cholesterol，TC）、游離脂肪酸（free"fatty"acids，FFA）水平。

1.4.3""蘇木精-伊紅染色觀察肝臟組織變化""10%中性福爾馬林溶液固定的脂肪組織，石蠟包埋，4μm連續切片，常規蘇木精-伊紅染色（hematoxylin"and"eosin"staining，HE染色），中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝臟組織的形態學改變。

1.4.4""反轉錄聚合酶鏈反應檢測各組織中相關mRNA表達""處死小鼠后，取皮下脂肪、內臟脂肪、肝臟等組織，Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書進行反轉錄反應和實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達。

1.4.5""蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達""取各組上述脂肪組織制備蛋白樣品，用BCA法測定蛋白濃度，蛋白質印跡技術檢測PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達。

1.5""統計學方法

采用SPSS"22.0統計軟件處理數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，非正態分布的計量資料行對數轉換后表示為均數±標準差（）再進行統計分析，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""實驗動物行為及體征觀察

各組小鼠的精神狀態良好，且皮毛光澤度好，造模組小鼠的體質量增加較快。造模12周后，造模組小鼠的平均體質量超過正常組平均體質量的20%，且Lee’s指數顯著高于正常組（Plt;0.01），造模組小鼠的腹圍顯著大于正常組（Plt;0.01），提示肥胖小鼠造模成功。造模組小鼠的飼料消耗量顯著高于正常組（Plt;0.01），見表1。

治療開始后，每周測量小鼠體質量，給藥6周后，測量小鼠體長、腹圍，并計算Lee’s指數。給藥1周至給藥結束后，模型組和低、中、高劑量組及陽性藥組小鼠的體質量均顯著高于正常組（Plt;0.01），見表2。給藥結束后，與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組及陽性藥組小鼠的Lee’s指數、體質量、腹圍顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低小鼠Lee’s指數、體質量、腹圍（Plt;0.05），陽性藥組具有相同作用；與陽性藥組比較，僅消脂合劑高劑量組小鼠的體質量降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見表3。

2.2""糖脂代謝水平檢測

給藥結束后，與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組及陽性藥組小鼠的FBG、FINS、TC、FFA均顯著升高（Plt;0.05），除模型組外，其余各組小鼠的TG無明顯差異（Pgt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低FBG、FINS、TC、TG、FFA（Plt;0.05），陽性藥組具有相同降低作用（Plt;0.05）；與陽性藥組比較，僅高劑量組小鼠的TC、TG無明顯差異（Pgt;0.05），余各組小鼠的FBG、FINS、TC、TG、FFA均顯著升高（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見表4。

2.3""HE染色觀察肝臟組織的病理改變

HE染色結果顯示，正常組小鼠的肝臟組織結構清晰，肝小葉結構正常；模型組小鼠的肝臟組織可見大量肝細胞發生脂肪變性，且有大小不一的空泡化細胞；與模型組比較，各給藥組小鼠的肝細胞脂肪變性和空泡化明顯減少，見圖1。

2.4""各組小鼠肝臟組織中PPARγ、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達比較

與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組小鼠的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達水平均顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性升高PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達水平（Plt;0.05），陽性藥組具有相同作用（Plt;0.05）；與陽性藥組比較，除高劑量組小鼠的PPARγ"mRNA表達水平無明顯變化（Pgt;0.05），高劑量組小鼠的mTOR"mRNA水平表達顯著升高（Plt;0.05）外，其余各組小鼠的PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達水平均顯著降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見圖2。

2.5""各組小鼠肝臟組織中PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達比較

與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組小鼠的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性上調PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達（Plt;0.05），陽性藥組具有相同作用（Plt;0.05）；與陽性藥組比較，除高劑量組PPARγ蛋白表達無明顯差異（Pgt;0.05）外，其余各組的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達顯著降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見圖3。

3""討論

中醫學對肥胖癥認識已久，古籍對本病的記載有“肥人”“肥貴人”“肥白人”“膏人”“肉人”“肥胖”“肥滿”等，最早可追溯到《素問·通評虛實論》“肥貴人，則責梁之疾也”。《靈樞·順逆肥瘦》亦提及其病因，“肥人……其為人也，貪于取與”，說明不正確的飲食習慣，尤其對含脂肪、糖類多的肥甘厚味攝取無度，脾的運化受到影響，水谷精微不化精血而成膏脂痰濁，蓄積體內，終成肥胖。又如《望診遵經》中提及“富貴者，身體柔脆，肌膚肥白，緣處深閨廣廈之間，此居養不齊，作息無度者易致脂肥停積而成肥人”，說明過逸少動，久臥久坐，導致氣機壅滯，血脈不暢，脾氣運化無力轉輸失調，若胃實脾虛者則能食而不消化，若脾虛濕滯者則濕邪滯留、痰濕內生，兩者均可致食滯不運而生肥胖。現代中醫體質學說研究表明，痰濕質、氣虛質是超重和肥胖的主要體質影響因素，且痰濕質的危險度高于氣虛質[2]。

根據《素問·經脈別論》“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈。脈氣流經，經氣歸于肺，肺朝百脈，輸精于皮毛……飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行”的人體代謝機制，總結出代謝疾病的主要發病機制：脾氣不升為本，痰濁內生為標。認為飲食過甚則傷脾，脾氣虛不能健運散精，谷氣（血糖、血脂等精微物質）留于血脈之中，化生痰濁，進而聚集于體內而成肥胖。故脾（氣）虛不運、痰濁內生是此類疾病發生的重要原因，即所謂“氣澀以遲”是“肥貴人則高粱之疾”的病機所在。

本研究發現，用藥后消脂合劑高劑量組小鼠的體質量、腹圍、Lee’s指數與模型組比較均顯著下降，低劑量組和中劑量組則效果不明顯，且效果在第5周開始顯現，提示消脂合劑效果可能與用藥時間呈正相關。對糖脂代謝的作用方面，消脂合劑呈劑量依賴性降低FBG、FINS、TC、TG、FFA，其中高劑量組對脂類（TC、TG）的影響與陽性藥組無明顯差異。經治療后，消脂合劑高劑量組對PPARγ的激活作用更明顯，同樣陽性藥組也表現出類似的作用。在PI3K/Akt/mTOR信號通路mRNA、蛋白的表達上，消脂合劑呈劑量依賴性上調PI3K、Akt、mTOR的蛋白和mRNA表達。前期研究已初步明確消脂合劑的基礎療效和作用機制[3-9]。現代藥理研究證明，消脂合劑中的主要有效成分黃芪多糖[10]、葛根素[11]、蒼術多糖[12]均有明顯的降糖作用，進一步機制研究亦表明黃芪、葛根配伍調控血糖、血脂的作用優于單一用藥，推測與其促進PPARγ"mRNA表達，調控AMP活化蛋白激酶信號通路有關[13-14]。絞股藍皂苷[15-17]、薏苡仁多糖[18]、紅景天可通過調節糖脂代謝，控制胰島素敏感性；其中絞股藍皂苷可上調PPARγ表達，是一種良好的PPARγ調節劑[19]；紅景天提取物可提高胰島素抵抗大鼠肝臟細胞PPAR-γ"mRNA表達[20]。茯苓多糖可通過激活PPARγ表達而抑制p38促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）磷酸化的方式作用于p38"MAPK/PPARγ信號通路[21]。紅曲通過增加主動脈PPARγ蛋白表達降低高脂血癥大鼠血脂水平[22]。臨床發現，與單味中藥比較，中藥復方君臣佐使配伍，兼顧主次，效果更好。

綜上所述，消脂合劑可調節肥胖小鼠的糖脂代謝，呈劑量遞增效果，其機制可能與調節PI3K/Akt/mTOR信號通路上調PPARγ水平有關。后續將進一步明確其作用的最優劑量，并對組方進行持續優化，以期為肥胖癥的治療提供數據支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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