小麥莖基腐病原菌定量檢測方法構建及應用

摘 """要：為進一步明確天津地區小麥莖基腐病發病狀況并開展防控預測，針對小麥莖基腐兩大主要病原菌假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌，建立病原菌實時熒光定量檢測體系。基于病原菌ITS序列設計并篩選出特異性引物Fpg-qrt-F/R和Bs-qrt-F/R，擴增片段大小分別為298 bp和116 bp。以病原菌基因組為標準品構建實時熒光定量標準曲線，建立了病原菌含量檢測方法，并對天津地區小麥莖基腐發病田小麥根際土壤及麥種中攜帶假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌的含量進行了定量檢測。試驗結果表明：天津地區發病田塊小麥根際土壤中假禾谷鐮刀菌基因組含量為0.343 8～77.686 7 pg.g-1，小麥根腐離蠕孢基因組含量為1.685 3～844.229 0 pg.g-1。此外對15個不同地區的小麥種子進行檢測，其中假禾谷鐮刀菌檢出率為40%，麥種帶菌量為0.261 7～0.269 0 pg.g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢。本研究建立了病原菌熒光定量檢測體系，摸清了天津地區小麥莖基腐的發病情況，確定了病田土壤中小麥莖基腐病原菌菌量的最低閾值，為相關土傳病害的發生提供早期預警。

關鍵詞：小麥莖基腐；假禾谷鐮刀菌；小麥根腐離蠕孢菌；熒光定量PCR

中圖分類號：S432.1 """""""""文獻標識碼：A """"""""DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.02.002

Construction and Application of Quantitative Detection Method for Pathogenic Bacteria in Wheat Stem Base Rot

LI Guangsheng1， LI Yuejiao1， SUN Shuqin1， WANG Li2， FENG Xueliang2， YANG Xiurong1

（1. Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China;2.Agricultural Development service Center of Tianjin， Tianjin 300061，China）

Abstract： To further identify the incidence of wheat crown rot in Tianjin area and preform disease prevention and control， areal-time PCR for quantitative detection of Fusarium pseudograminis and Bipolaris sorkiniana was established. The specific primers Fpg-qrt-F/R and Bs-qrt-F/R amplified the fragment of 298 bp and 116 bp were designed based on the rDNA ITS sequence of F.pseudograminis and B.sorkiniana. A standard curve established using genome of pathogens， was used to investigate the content of F.pseudograminis and B.sorkinianain wheat rhizosphere soil and seed samples in Tianjin area. Using real-time PCR detection system， thegenomic content of F.pseudograminis and B.sorkiniana in wheat rhizosphere soil was 0.343 8-77.686 7 pg.g-1 and 1.685 3-844.229 0 pg.g-1. In addition， the detection rate of F. pseudograminis in wheat seeds samples of 15different areas was 40%， with pathogen content range of 0.261 7-0.269 0 pg.g-1. And there was no B.sorkiniana dectected. The results indicated the incidence of wheat crown rot in Tianjin area and determined the minimum threshold of pathogen in soil， which provide an early warning of the occurrence of soil-borne diseases.

Key words： wheat stem base rot; Fusarium pseudograminis; Bipolaris surkiniana; fluorescence quantitative PCR

小麥是我國的三大主要糧食作物之一，年產量約占主要糧食作物總產量的20%[1]。天津市每年種植小麥面積為10～11.33萬hm2，主要集中在武清區、寶坻區、靜海區、薊州區和北辰區等。近年來，氣候變暖、秸稈還田等因素導致土壤中病原菌的積累，加上耕作制度演變等諸多因素的影響，小麥土傳病害的發生與危害不斷加重[2]。小麥莖基腐病是一種典型的土傳性病害，目前許多學者研究結果顯示其可由多種病原菌侵染發病[3-6]，在天津地區小麥莖基腐、小麥根腐和小麥紋枯病為主要發生的小麥土傳病害。其中小麥莖基腐作為近年來發病程度逐年上升的一種土傳病害受到廣泛關注，其可減產35%左右，甚至導致部分麥田絕收，嚴重威脅小麥安全生產。目前防治小麥莖基腐病主要是依賴化學藥劑，生產中尚無抗病品種推廣[7-8]。因此，小麥莖基腐已成為制約小麥高產、優質生產的重要限制因素[9]。

據調查，近年來天津市小麥土傳病害發生普遍，特別是小麥莖基腐病的發生有逐年上升的趨勢，嚴重地塊已經引起死苗死蘗現象，造成減產30%以上。筆者前期對引發天津地區小麥莖基腐病原菌進行了分離鑒定，結果表明優勢菌株為假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌。目前，針對作物病原菌檢測多數學者以qPCR作為研究方法，其具有精準度高，特異性強并且可以做到定量檢測[10-12]，已在植物病原菌快速定量檢測中發揮了重要作用[13-14]。張麗霞等[15]通過熒光定量檢測技術構建了蘋果褐斑病菌定量檢測體系，用于該病害早期無癥狀快速檢測。徐娜娜[16]運用實時熒光定量PCR技術對土壤中小麥紋枯病菌的含量及動態進行了研究。曹學仁[17]開發了基于qPCR技術的捕捉器中小麥白粉菌孢子濃度的定量檢測技術，為小麥白粉病的病情動態變化提供監測預警。潘娟娟等[18]應用qPCR技術構建的小麥條銹菌定量檢測技術，對處于潛育狀態下的病葉進行了監測，對該病害的預測、防治提供了科學依據。為確保小麥生產保質保量，本研究以天津地區小麥莖基腐病害為內容，運用熒光定量實時檢測技術構建發病田土壤環境和種子中病原菌含量快速檢測方法，確定引發小麥莖基腐發病的土壤中病原菌最低含量，以此為農業生產中小麥莖基腐病害防治提供預警技術，為我國小麥安全生產提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株：本研究所用供試菌株均為田間采集，實驗室分離純化經鑒定后保存，假禾谷鐮刀菌特異性對照菌株編號如下： 編號1和編號2為不同地區采集的假禾谷鐮刀菌；編號3：尖孢鐮刀菌；編號4：金合歡鐮刀菌；編號5：玉米莖基腐病原菌；編號6：小麥赤霉病病原菌；編號7：小麥紋枯病病原菌；編號8：麥根腐離蠕孢菌。小麥根腐離蠕孢菌特異性對照菌株編號如下：編號1為小麥根腐離蠕孢菌；編號2：玉米生平臍蠕孢菌；編號3：稻平臍蠕孢菌；編號4：刺腐霉菌；編號5：小麥赤霉病病原菌；編號6：小麥紋枯病病原菌；編號7：假禾谷鐮刀菌。

土壤樣品：樣品取自北辰、武清、寶坻、靜海區21個村莊發病田塊，這些土壤長期種植小麥，施化肥和農家肥，秸稈全部還田，實行小麥、玉米輪作制度。農田土壤類型均為褐土，采樣深度為表層土下10～20 cm，按 5點取樣法，混勻放入無菌容器中，-20 ℃保存。

小麥種子：取自于15份不同來源的小麥品種，取一定量小麥種子研磨成粉狀后待用。

儀器：水浴鍋（DK-80型，上海一恒科技有限公司）、離心機（D-37520，德國SIGAM公司）、電泳儀（DYY-60型，北京六一生物科技有限公司）、普通PCR（TC-E-480，杭州博日科技股份有限公司）、熒光定量PCR（QuantStudioTM 1 PLUS，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）、高通量組織研磨器（SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）、移液器（德國eppendorf公司）。

試劑：土壤基因組DNA提取試劑盒（OMEGA soil DNA Kit" D5625-01），TB-MIX（天津為科生物技術有限公司）、CTAB法提取組織DNA相關試劑。

1.2 提取方法

土壤微生物DNA提取方法：首先將所取土壤樣品中雜質去除，包括一些腐敗植物體、昆蟲殘體等，土壤樣品經網篩過篩，過篩后土壤樣品用于DNA提取，提取使用OMEGA soil DNA Kit （D5625-01）土壤DNA提取試劑盒；小麥種子及保存的病原菌使用CTAB法進行DNA提取[19]。

1.3 引物設計與合成

依據前期實驗對天津地區小麥莖基腐病菌分離鑒定結果，明確天津地區小麥莖基腐病原菌的優勢菌株為假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）和小麥根腐離蠕孢菌（Bipolaris sorkiniana）。依據假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌ITS序列設計特異性引物分別為：

假禾谷鐮刀菌特異性引物：

Fpg-qrt-F：GGGGTAGTTTCACATTTCCG

Fpg-qrt-R： AATGATTTGTGGGAGGAGGG

小麥根腐離蠕孢菌特異性引物：

Bs-qrt-F：CGGATCTCTTGGTTCTGGCAT

Bs-qrt-R：GAATACCAAAGGGCGCAATGT

該引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 引物特異性驗證

使用CTAB法對8種實驗室保存的病原菌DNA進行提取，使用ddH2O作為空白對照，使用由上海生工生物工程技術服務有限公司合成的2對引物進行普通PCR擴增，以此檢測所設計引物的特異性。

PCR反應體系建立如下：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×T5 Direct PCR Mix 10 μL，ddH2O補足至20 μL。擴增程序：98 ℃預變性3 min，98 ℃預變性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。隨后將PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析電泳結果。

qPCR反應體系建立如下：qPCR 反應體系（20 μL）包括TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL， DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。qPCR 擴增條件為95 ℃、30 s，然后95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環，于72 ℃時測定熒光值。

1.5 引物靈敏度分析

利用稀釋成系列濃度的假禾谷鐮刀菌、小麥根腐離蠕孢菌ITS序列擴增后的PCR產物作為模板，采用普通PCR檢測模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴增出特異性條帶。

1.6 實時熒光定量PCR及DNA標準曲線的建立

對以假禾谷鐮刀菌DNA和小麥根腐離蠕孢菌DNA為模板擴增出的PCR產物進行純化，純化后的產物作為標準品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進行熒光定量PCR擴增。以起始模板濃度的對數值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，分別建立假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌定量檢測的標準曲線。

1.7 qPCR定量檢測應用

采集21份天津地區小麥莖基腐發病田中根際土，收集15份不同來源的小麥品種子，分別采用試劑盒和CTAB的方法進行DNA提取，再利用本試驗中建立的定量檢測方法對其中小麥莖基腐病原菌和小麥根腐離蠕孢病原菌含量進行檢測。

2 結果與分析

2.1 引物特異性與靈敏度分析

根據針對假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌分別設計的2對引物進行普通PCR擴增，結果顯示引物Fpg-qrt-F/R和引物Bs-qrt-F/R的特異性良好，分別以假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢的基因組為擴增模板，可對應獲得298 bp特異性條帶和116 bp特異性條帶，表明該設計引物對小麥其他致病菌所提取的基因組不產生擴增條帶，特異性良好（圖1-A、圖1-B）。

利用稀釋成系列濃度的假禾谷鐮刀菌ITS序列擴增后的PCR產物作為模板，采用普通PCR檢測模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴增出特異性條帶。試驗結果表明，普通PCR能夠檢測假禾谷鐮刀菌DNA樣品的靈敏度為100 pg·μL-1（圖2-A）。

利用稀釋成系列濃度的小麥根腐離蠕孢菌ITS序列擴增后的PCR產物作為模板，采用普通PCR檢測模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴增出特異性條帶。試驗結果表明，普通PCR能夠檢測小麥根腐離蠕孢菌DNA樣品的靈敏度為1 ng·μL-1（圖2-B）。

2.2 實時熒光定量PCR及DNA標準曲線的建立

對以假禾谷鐮刀菌DNA為模板擴增出的PCR產物進行純化，純化后的產物作為標準品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進行熒光定量PCR擴增。結果如圖3-A所示，以起始模板濃度的對數值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，建立假禾谷鐮刀菌定量檢測的標準曲線。標準曲線為y=-3.742 7x+

21.688，相關系數R2為0.9976，擴增效率為85.5%，可用于下一步小麥中假禾谷鐮刀菌含量的檢測。

對小麥根腐離蠕孢菌DNA為模板擴增出的PCR產物進行純化，純化后的產物作為標準品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進行熒光定量PCR擴增。結果如圖3-B所示，以起始模板濃度的對數值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，建立小麥根腐離蠕孢的定量檢測的標準曲線。標準曲線為y=-3.715x+26.28，相關系數R2為0.999，擴增效率為85.83%，可用于下一步小麥中小麥根腐離蠕孢菌含量的檢測。

2.3 小麥根際土及種子帶菌量檢測

利用已構建的假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌定量檢測標準曲線，2020—2022年分別對北辰、武清、寶坻、靜海區21個村莊發病田塊中小麥根際土中病原菌進行了檢測，均檢測出假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌，帶菌率為100%。假禾谷鐮刀菌檢出濃度為0.343 8～77.686 7 pg·g-1，小麥根腐離蠕孢檢出濃度為1.685 3～695.860 8 pg·g-1，見表1。

分別對15份不同來源的小麥品種進行了病原菌檢測，結果見表2。其中，6份種子檢測出假禾谷鐮刀菌，檢出率為40%，含量為0.261 7～0.269 0 pg·g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢菌。

3 討論與結論

小麥莖基腐病是一種由多種真菌引發的土傳性病害。李月嬌等[20]通過采集天津地區小麥莖基腐發病樣本進行分離鑒定，表明造成天津地區小麥莖基腐的主要病原菌為假禾谷鐮刀菌，其次為小麥根腐離蠕孢菌。近年來，隨著秸稈還田等耕作方式的倡導，使得地表秸稈中攜帶一定量的病原菌，同時增加了土壤中病原菌的含量。通過前期調研，天津地區小麥莖基腐病發生趨勢逐年上升，已經對生產造成一定的影響，限制了產量和品質的有效提升。小麥莖基腐病前期發病癥狀與其他土傳病害癥狀相似無法準確區分，后期癥狀明顯，已無防治意義。因此，在發病初期對小麥莖基腐病原菌含量進行監測有助于盡早防控，減少損失。常規PCR檢測靈敏度不高且無法做到定量檢測，qPCR檢測技術可以做到高特異性和高靈敏度且能夠做到定量檢測，是目前監測和檢測病原菌含量的重要技術手段[21-23]。

本研究通過設計假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌兩對特異性引物，結合qPCR技術建立標準曲線，驗證并獲得定量檢測病原菌的方法。運用該檢測方法，對從21個小麥莖基腐發病田中采集的根際土樣進行菌量檢測，結果顯示假禾谷鐮刀菌最小檢出濃度為0.343 8 pg·g-1，小麥根腐離蠕孢最小檢出濃度為1.685 3 pg·g-1，說明當土壤中2種菌的含量分別達到各自的最低檢出濃度時，該小麥田塊有可能受到小麥莖基腐病的危害，應當及時采取相應的防控措施。姜戚[24]利用小麥室內盆栽試驗結果顯示，當盆栽土壤中假禾谷含量達到200 pg·g-1以上時，在適宜的條件下可引發小麥莖基腐病的發生，本研究為大田環境進行檢測，受多種環境因素影響可能較室內盆栽環境更容易發病。筆者同時對15份不同來源的小麥種子病原菌含量進行了檢測，結果顯示小麥種子假禾谷鐮刀菌帶菌率為40%，含量為0.261 7～0.269 0 pg·g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢菌，小麥種子上只檢測出假禾谷鐮刀菌。原因可能是后期侵染造成，而小麥根腐離蠕孢不能侵染小麥穗部。

本研究運用熒光定量實時檢測技術構建了一種用于定量檢測小麥莖基腐病原菌含量的方法，并在天津地區的小麥生產田進行了應用，通過對小麥根際土和小麥種子進行定量檢測，掌握了天津地區小麥莖基腐發病土壤的最低病原菌含量，同時也提供了一種防治小麥莖基腐的預警機制，為生產上及時對小麥莖基腐病進行防控提供依據。

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收稿日期： 2024-02-02

基金項目：重要種子有害生物精準快速檢測技術研究（2022ZYCX017）；“河北省重點研發計劃農業高質量發展關鍵共性技術攻關專項（19226505D）

作者簡介：李廣勝（1986—），男，天津人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害與綠色防控技術研究。

通訊作者簡介：楊秀榮（1972—），女，天津人，正高級農藝師，主要從事病害發生發展規律、病原菌與品種互作關系，生防菌控害效能研究。