基于EST-SSR分子標記的萱草親緣關系分析

摘 """要：萱草是極具觀賞價值的多年生宿根草本植物，在我國具有悠久的栽種歷史。為了探明36個萱草品種間的親緣關系，利用毛細管電泳熒光標記技術對36個萱草品種進行了EST-SSR分子標記檢測，利用11對多態性良好的引物對36份供試萱草材料進行PCR擴增。結果顯示：11對引物共獲得40個多態性位點，樣本平均有效等位基因數為2.58個，平均Shannon多樣性指數為1.00，平均期望雜合度為0.57，平均觀察雜合度為0.52；以遺傳距離矩陣為分析對象，36個萱草品種間的遺傳距離為0.05～0.70，利用NTSYS軟件按UPGMA法聚類結果顯示，遺傳距離0.48為閾值時，36種萱草品種分為2個大類，遺傳距離0.414為閾值時，可進一步將第1大類分為4個亞類。綜上，供試的36個萱草品種之間具有較高的遺傳多樣性和較為豐富的遺傳背景，為今后培養萱草優良新品種提供了一定的理論依據。

關鍵詞：萱草；EST-SSR分子標記；親緣關系

中圖分類號：S682.1+9 """""""""""文獻標志碼：A """"""""""DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.02.001

Kinship Analysis of Hemerocallis fulvay Plants Based on EST-SSR Molecular Markers

ZHAO Yufan1， CHU Boyan2， LIU Susu1， ZHAO Lihong1， LI Jinxia2， YIN Xinyan2

（1.Hebei Agricultural University， College of Landscape Architecture and Tourism， Baoding， Hebei 071000， China；2. Hebei Academy of Forestry and Grassland Science， Shijiazhuang， Hebei 050061， China）

Abstract： Hemerocallis fulvay is a perennial hosta with great ornamental value and has a long history of cultivation in China. In order to explore the kinship relationship among 36 Hemerocallis fulvay species. In this study， EST-SSR molecular marker detection of 36 Hemerocallis fulvay species was carried out by capillary electrophoresis fluorescence labelling technique， and PCR amplification of 36 test Hemerocallis fulvay materials was carried out using 11 pairs of primers with good polymorphism. The results showed that a total of 40 polymorphic loci were obtained from the 11 primer pairs， with an average number of 2.58 effective alleles in the samples， an average Shannon diversity index of 1.00， an average expected heterozygosity of 0.57， and an average observed heterozygosity of 0.52. Analysed by the genetic distance matrix， the genetic distances among the 36 Hemerocallis fulvay varieties ranged from 0.05 to 0.70， the clustering results by UPGMA method using NTSYS software showed that the 36 Hemerocallis fulvay varieties were classified into two major classes when the genetic distance of 0.48 was the threshold， and the first major class could be further divided into four subclasses when the genetic distance of 0.414 was the threshold. In conclusion， "the 36 Hemerocallis fulvay varieties for testing have high genetic diversity and richer genetic backgrounds， which provides a certain theoretical basis for cultivating excellent new varieties of Hemerocallis fulvay in the future.

Key words： Hemerocallis fulvay; EST-SSR molecular markers; parentage

萱草（Hemerocallis fulvay），阿福花科（Asphodelaceae），萱草屬（Hemerocallis）的多年生宿根草本花卉，別名黃花菜、鹿蔥等，觀賞價值高，抗性好，是當前被廣泛使用的園林綠化植物[1]。萱草屬原生種14種，其中11種為我國原產。中國是萱草屬植物品種最全，分布范圍最廣的國家，但有關研究卻落后于國外[2]。

近年來，隨著分子標記技術的不斷發展和完善，其在植物研究中的使用越來越普遍，在萱草相關研究中使用分子標記技術也屢見不鮮。朱華芳等[3]通過在表型性狀的基礎上結合簡單重復序列標記（SSR，Simple Sequence Repeat）進行聚類分析后，將Stella De Oro、Little Wine Cup等14個萱草品種、黃花菜和萱草1個變種歸為一類，將北黃花菜、小黃花菜和重瓣萱草歸為一類。黎海利等[4]通過擴增片段長度多態性（AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism）技術對9種萱草野生種和26個栽培品種進行親緣關系鑒定，將其分為早花、中花、晚花3類。侯非凡[5]使用表達序列標簽（EST-SSR）標記首次構建了一張黃花菜種內遺傳圖譜和一張黃花菜與萱草種間遺傳圖譜。Masuda等[6]開發了12個EST-SSR標記，用于評價萱草的遺傳多樣性和遺傳結構。Cao等[7]利用ISSR分子標記技術對太行山野生黃花菜進行遺傳多樣性分析，結果發現可以將其分為3類，野生品種和黃花菜為1類，美國和新西蘭的品種為另外2類。

簡單重復序列標記（Simple Sequence Repeat）簡稱SSR，是基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA，其具有良好的重復性、共顯性、易于操作的優點[8]，現已在植物各水平遺傳多樣性、分子系統學、品種和純度鑒定、基因定位、遺傳圖譜構建、比較基因組學等領域被廣泛應用。SSR在對植物種下等級親緣關系、種質鑒定等研究中，與其他分子標記相比表現出明顯優勢。其可分為基因組SSR標記和表達序列標簽（EST-SSR）標記2類，后者周期短，開發成本低，在同屬植物中通用性好。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法步驟繁多、耗時耗力、靈敏度低；而SSR毛細管電泳熒光標記技術可直接讀取目的片段準確大小，極大地降低了分辨擴增產物的難度，提高了研究的效率和準確性[9]。故本研究采用SSR毛細管電泳熒光標記技術，利用11對引物對36個萱草品種進行親緣關系分析，以期為萱草品種的分類、選育、鑒定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇栽植于河北省林業和草原科學研究院萱草試驗基地的36個萱草品種作為試驗材料，并編號為1～36，具體信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法提取萱草葉片中的DNA。參照張曉祥等[10]小麥DNA的提取辦法，并略作修改。取新鮮材料的葉子，剪碎置于離心管中，用液氮研磨成粉末，加入65 ℃預熱的CTAB提取液1 mL，迅速搖勻，65 ℃水浴加熱40 min；加入氯仿∶異戊醇（24∶1）400 μL，搖勻，12 000 r·min-1離心5 min；將上清液轉到新的離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇，混勻，以12 000 r·min-1離心5 min，再將上清液轉到新的離心管中，加入等體積預冷（-20 ℃）的異戊醇，充分混勻，12 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液；加入75 %乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1離心2 min，棄去上清液；加入75 %乙醇洗滌沉淀，以12 000 r·min-1離心2 min，棄去上清液；2 000 r·min-1離心1 min，取出殘液，晾干沉淀，加入緩沖液（Elution buffer）溶解DNA，-20 ℃條件下保存。

使用紫外分光光度計檢測36份萱草樣品的DNA純度。

1.2.2 引物合成 本研究所用引物均由太和生物科技有限公司合成，引物信息詳見表2。

1.2.3 PCR反應體系 PCR反應體系總體積為20 μL，其中包含模版DNA（50 ng·μL-1）2 μL，正向引物（F）0.5 μL，反向引物（R）1 μL，熒光標記M13 0.5 μL，Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 5.5 μL。熱循環程序為：94 ℃預變性5 min，然后進入溫度循環：94 ℃變性45 s，不同溫度條件退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；最后60 ℃延伸30 min，4 ℃保存。

1.2.4 熒光標記毛細管電泳 PCR產物送至太和生物科技有限公司進行熒光標記毛細管電泳。

1.2.5 觀賞特性和花期調查 在萱草的生長期（3—8月）對36個萱草品種的花色、花朵直徑、花葶高度、始花期、盛花期5個指標進行調查。其中，使用直尺測量花葶高度和花朵直徑，使用皇家園藝比色卡測定花色性狀，使用目測法記錄始花期、盛花期。

1.2.6 數據分析 用GeneMaker對樣品原始數據進行分析，使用GenALEx6.51b2計算等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農多樣性指數（I）、固定指數（F）。利用populations-1.2.32計算出遺傳距離；通過NTsys2.10e軟件使用UPGMA法繪制聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 多態性分析

通過11對引物的電泳結果，對36份樣品的位點多態性進行分析，分析結果見表3。11對SSR引物共擴增出40個多態位點，單個點位的等位基因數為2～7個，平均值為3.64；有效等位基因數為1.30～4.82個，平均值為2.58；HHC32的等位基因和有效等位基因數最多，其次是SAU01106；等位基因數最少的是HHC53和HHC65，有效等位基因數最少的是HHC65。觀測雜合度和期望雜合度分別是0.29～0.97（0.52）和0.23～0.79（0.57），觀測雜合度和期望雜合度最高的均是HHC32，最低均是SAU00063。Shannon指數為0.45～1.71（1.0），指數最高的是HHC32，指數最低的是SAU00063。

2.2 品種間遺傳距離分析和UPGMA法聚類分析

不同種質資源的親緣關系與其遺傳背景有直接關系，遺傳背景越近，則相似程度越高。根據36份萱草種質材料的SSR擴增結果，計算得到萱草36份樣本間的遺傳距離矩陣。遺傳距離為0.05～0.70，夜光燈和黑王子之間親緣關系最近，遺傳距離為0.05；凝望2和科技之光之間親緣關系最遠，遺傳距離為0.70。

以36個萱草品種的遺傳距離為分析對象，利用NTsys軟件以UPGMA法聚類分析，構建了36份萱草樣本的分子系統樹（圖1）。親緣關系進化樹的聚類結果顯示，以遺傳距離0.48為閾值，可以將36個萱草品種分為2個類群：第1大類包括34個品種；第2大類包括2個品種，為布魯克伍德素考與科技之光。以遺傳距離0.414為閾值，可以將第1大類分為4個亞群：第1亞群包括凝望2、藍紫色寶貝和層雪等13個品種，其花色以粉色、紫色偏多，花葶高度均值64 cm，始花期集中在6月中下旬；第2亞群包括紅浩、紅緣2和白珍珠等8個品種，花色以紅色偏多，花葶高度均值52 cm，但不整齊，最低為37 cm，最高的達70 cm；第3亞群包括英月、風車和吉星高照等5個品種，花色紅色和橙色偏多，花葶高度集中在62～68 cm，均值65 cm，比較整齊；第4亞群包括夜光燈、黑王子和桔色風暴等8個品種，花色黃色偏多，花葶比較高，均值達到了71 cm。

3 討論與結論

隨著生態和節約理念與園林綠化的有機結合，宿根花卉的重要性日益凸顯[11]，萱草以多種形式在園林綠化中大面積使用，因其極具觀賞性和良好的抗逆性，是具有一定觀賞價值的優良園林花卉。SSR分子標記具有復性好、共顯性、易于操作的特點，是常用的親緣關系分析方法之一，但利用EST-SSR標記對萱草屬植物進行親緣關系分析的研究較少。張賀蕾等[12]和葉遠俊等[13]均利用SSR標記的方法分別對34個重瓣萱草品種和60個萱草品種進行了遺傳多樣性分析，測定了平均等位基因數、平均Shannon指數、平均期望雜合度、平均觀測雜合度。本研究用11對引物對36份樣品的位點多態性進行分析，多項指標略低于以往的研究結果。原因可能與選擇的萱草品種有關，本研究所選用的多為雜交品種，未選擇萱草屬其余物種。

各物種彼此之間的親緣關系遠近可以用遺傳距離的大小來反映[14-16]。遺傳距離越大，遺傳相似性越低；遺傳距離的變幅越大，遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越豐富[17]。本研究中，36個萱草品種的遺傳距離范圍為0.05～0.70，表明品種之間具有較高的遺傳多樣性和較豐富的遺傳背景。UPGMA法聚類分析結果顯示，遺傳距離0.48為閾值時，36種萱草品種分為2個大類，遺傳距離0.414為閾值時，可進一步將第1大類分為4個亞類，與朱華芳[3]等的研究結果相類似。

今后，應對遺傳相似系數較低的萱草品種進行基因資源的深入挖掘，為推動萱草的分子育種提供參考和依據，以期培育出更多優良萱草品種。

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收稿日期：2023-12-19

基金項目：河北省現代種業科技創新專項—花卉現代種業科技創新團隊（21326317D）

作者簡介：趙玉帆（2000—），女，河北邢臺人，在讀碩士生，主要從事園林植物遺傳育種與栽培技術研究。

通訊作者簡介：李金霞（1978—），女，遼寧朝陽人，高級工程師，碩士，主要從事園林植物學研究。