蜂膠軟膠囊中總黃酮測(cè)定方法的改進(jìn)

摘 要：蜂膠中富含大量總黃酮類化合物，黃酮類化合物具有豐富的藥理作用。對(duì)蜂膠軟膠囊參照GB/T 20574—2006檢測(cè)時(shí)，加入顯色劑用水定容后，溶液變渾濁，影響分光光度計(jì)吸光度測(cè)定的穩(wěn)定性，本文對(duì)其前處理?xiàng)l件、定容溶液、顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、加標(biāo)回收率進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在415 nm處，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在含量為0.2～1.2 mg時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.734 1x-0.005 6（R=0.999 8），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，加標(biāo)回收率為92.0%～97.0%。

關(guān)鍵詞：蜂膠軟膠囊；總黃酮；分光光度法

Improvement of the Determination Method for Total Flavonoids in Propolis Soft Capsules

ZHOU Lu1，2， HUANG Ting1，2， DONG Yao1，2

（1.Jiangsu Provincial Productivity Promotion Center， Nanjing 210001， China;

2.Jiangsu Provincial Physical and Chemical Testing Center， Nanjing 210001， China）

Abstract： Propolis is rich in a large amount of total flavonoids， which have rich pharmacological effects. When testing propolis soft capsules with reference to GB/T 20574—2006， the solution became turbid after adding a colorimetric agent to a constant volume of water， which affected the stability of the spectrophotometer absorbance measurement. The pre-treatment conditions， constant volume solution， and colorimetric time were improved， and the method standard curve， detection limit， repeatability， and spiked recovery rate were verified. The results showed that at 415 nm， the content of rutin was 0.2～1.2 mg， and the linear regression equation was y= 0.734 1x-0.005 6 （R=

0.999 8）， the relative standard deviation was 0.9%. The recoveries were 92.0% ～ 97.0%.

Keywords： propolis soft capsules; total flavonoids; spectrophotometry

蜂膠是由蜜蜂，特別是工蜂，從植物的樹膠、樹脂中采集，并與上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物[1]。現(xiàn)代研究結(jié)果表明，蜂膠含有維生素、酚類、蓓烯類、黃酮類化合物等多種營(yíng)養(yǎng)保健成分。在蜂膠的眾多活性物質(zhì)中，黃酮類物質(zhì)是最為關(guān)鍵的成分之一，它具有抗菌、殺毒、消炎止痛、降血脂、促進(jìn)機(jī)體組織再生和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功效[2]。

近年來(lái)，蜂膠產(chǎn)品在市場(chǎng)上受到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可，其種類也日益豐富，主要以膠囊形式呈現(xiàn)。蜂膠中主要活性成分為黃酮類化合物，已成為研究熱點(diǎn)，且市售的蜂膠膠囊類產(chǎn)品均以總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。黃酮類化合物的測(cè)定有多種方法，如液相色譜法﹑分光光度法等，液相色譜法可以測(cè)定單一的黃酮成分，分光光度比色法可以測(cè)定黃酮成分的總量[4-5]。紫外分光光度法被廣泛應(yīng)用于測(cè)定蜂膠制品中的總黃酮含量，因?yàn)樗哂胁僮骱?jiǎn)便、準(zhǔn)確度高且易于實(shí)施的特點(diǎn)，因此深受廣大研究者的青睞。

1 材料與方法

1.1 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量95.5%，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)2251131）；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、95%乙醇、醋酸鉀（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

UV-1801紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；KH2-250DB超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；TGL-15B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BT25S十萬(wàn)分之一電子天平、BSA224S-CW電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)《蜂膠中總黃酮含量的測(cè)定方法 分光光度比色法》（GB/T 20574—2006），利用分光光度比色法對(duì)蜂膠軟膠囊中的總黃酮進(jìn)行定量分析。

1.3.1 試樣的制備

稱取蜂膠軟膠囊內(nèi)容物0.5 g（精確至1 mg）于燒杯中，加入95%乙醇約30 mL，室溫下超聲提取20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，加入95%乙醇至刻度線，混合均勻后進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液，收集濾液待測(cè)。

準(zhǔn)確吸取1.0 mL待測(cè)溶液于50 mL容量瓶中，分別加入1.0 mL硝酸鋁溶液和1.0 mL醋酸鉀溶液，加95%乙醇至刻度，搖勻，靜置10 min，3 000 r·min-1離心3 min，取上清液待測(cè)。

空白實(shí)驗(yàn)精密吸取1.0 mL待測(cè)溶液于50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。用1 cm比色皿，在415 nm以空白試液作參比，測(cè)定樣品吸光度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

稱取10.50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量95.5%）于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻，溶液濃度為0.2 g·L-1。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL（相當(dāng)于蘆丁含量0 mg、0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg、0.8 mg、1.0 mg和1.2 mg），分別置于50 mL容量瓶中，向容量瓶中加入1.0 mL硝酸鋁溶液和1.0 mL醋酸鉀溶液，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min后測(cè)定。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算

總黃酮計(jì)算公式為

式中：X為黃酮類化合物的總含量，%；m1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出測(cè)定液中蘆丁質(zhì)量，mg；m為樣品的質(zhì)量，g；d為稀釋比例。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣前處理方法的改進(jìn)

國(guó)標(biāo)方法中稱取樣品0.5 g，置于燒杯中，加入95%乙醇約30 mL，然后將燒杯置于65 ℃水浴中加熱45 min，攪拌使之溶解，國(guó)標(biāo)前處理時(shí)間較長(zhǎng)。本文分別研究了室溫下不同超聲提取時(shí)間、振蕩提取時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲提取時(shí)間分別為5 min、20 min、40 min時(shí)，總黃酮測(cè)定結(jié)果分別為7.53%、7.70%、7.68%；振蕩提取時(shí)間分別為5 min、20 min、40 min時(shí)，總黃酮測(cè)定結(jié)果分別為7.34%、7.52%、7.65%。通過(guò)對(duì)比，超聲提取5 min，提取不完全，總黃酮測(cè)定結(jié)果偏小，超聲提取20 min和40 min的測(cè)定結(jié)果差別不大；振蕩提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取越完全，測(cè)定結(jié)果越高；且相同時(shí)間下，超聲提取比振蕩提取效果好、測(cè)定結(jié)果高。因此，考慮時(shí)間、操作簡(jiǎn)單快捷等因素，實(shí)驗(yàn)采用超聲提取20 min。

2.2 樣品顯色溶液的改進(jìn)

按國(guó)標(biāo)方法測(cè)定時(shí)，溶液出現(xiàn)渾濁，搖勻后出現(xiàn)較多小氣泡，比色時(shí)吸光度不穩(wěn)定，分光光度法測(cè)定時(shí)需溶液澄清透明。嘗試將渾濁樣液用濾紙過(guò)濾，發(fā)現(xiàn)過(guò)濾后溶液仍然不澄清，又嘗試將溶液離心，均不能得到澄清透明的測(cè)定液。最后本文將國(guó)標(biāo)加水稀釋至刻度，改為加95%乙醇稀釋至刻度，溶液比加水至刻度更加渾濁，離心后，離心管底部有大量白色沉淀，溶液澄清透明，可直接用于比色。國(guó)標(biāo)法與改進(jìn)后吸光度穩(wěn)定性對(duì)比詳見(jiàn)表1，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后吸光度值更穩(wěn)定。

2.3 顯色時(shí)間的改進(jìn)

國(guó)標(biāo)方法搖勻后需靜置1 h，時(shí)間較長(zhǎng)，本文研究了不同顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響。選取標(biāo)準(zhǔn)曲線0.6 mg單點(diǎn)，分別在顯色時(shí)間2 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min進(jìn)行吸光度測(cè)定，吸光度詳見(jiàn)表2，發(fā)現(xiàn)10 min后吸光度值趨于穩(wěn)定，所以將顯色時(shí)間改為10 min。

2.4 方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁含量為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），得到線性回歸方程為y=0.734 1x-0.005 6，相關(guān)系數(shù)R=0.999 8。由表3可知，蘆丁質(zhì)量在0.2～1.2 mg，與溶液的吸光度值有著良好的線性關(guān)系。

2.4.2 方法重復(fù)性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

（1）重復(fù)性測(cè)定。稱6份試樣，按改進(jìn)后的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果詳見(jiàn)表4。6次總黃酮含量測(cè)定的平均值為7.69%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，RSD值≤5%，方法重復(fù)性良好。

（2）加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。稱取蜂膠軟膠囊樣品3份，分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，使樣品中總黃酮含量增加0.5%、1.0%、3.0%，結(jié)果詳見(jiàn)表5，加標(biāo)回收率為92.0%～97.0%，滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。

3 結(jié)論

分光光度法對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單、具有較好的穩(wěn)定性，易于推廣普及。通過(guò)對(duì)國(guó)標(biāo)方法的前處理?xiàng)l件、定容溶液、顯色時(shí)間進(jìn)行改進(jìn)，研究并確定檢測(cè)蜂膠軟膠囊中總黃酮含量的最佳方法。將蜂膠軟膠囊內(nèi)容物超聲提取20 min，用95%乙醇定容，顯色10 min后，離心后測(cè)定，方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，可用于蜂膠軟膠囊中總黃酮的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

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[5]楊歡，劉越，杜旭剛.等.蕎麥及其制品中總黃酮含量測(cè)定的方法篩選[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（8）：3313-3320.

作者簡(jiǎn)介：周璐（1990—），女，江蘇南京人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析測(cè)試。