芪參六味方抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制

黃麗君 董菲 高群 賈文浩 肖華麗 余林波 毛天詩 惠嫣然 林謙 周鹍

摘要 目的：研究芪參六味方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌纖維化的作用及機(jī)制。方法：構(gòu)建SHR模型，將大鼠分為模型組、中藥低濃度組、中藥高濃度組、西藥組，另以同齡Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作為對(duì)照組，每組6只，干預(yù)12周。干預(yù)12周后進(jìn)行心功能檢測，計(jì)算心臟收縮功能指標(biāo)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）及心臟舒張功能指標(biāo)舒張?jiān)缙诳缍獍暄魉俣龋‥）與舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)運(yùn)動(dòng)幅度（E′）的比值E/E′；干預(yù)12周后處死大鼠，取左心室心肌組織，進(jìn)行苦味酸-天狼猩紅染色后觀察心肌間質(zhì)中膠原纖維總面積及Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原面積，計(jì)算兩種膠原面積比值；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織中心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）與內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）相關(guān)血小板-血管內(nèi)皮黏附分子（CD31）、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、人成纖維細(xì)胞特異蛋白1（FSP1）的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測EndMT相關(guān)指標(biāo)CD31、VE-Cadherin、α-SMA、FSP1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：干預(yù)12周后，與模型組相比，中藥高劑量組降低心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)（P＜0.05），中藥高劑量組與西藥組均可降低心肌間質(zhì)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），改善大鼠心臟舒張功能E/E′（P＜0.01），降低EndMT相關(guān)蛋白α-SMA、FSP1蛋白表達(dá)及VE-Cadherin、α-SMA mRNA表達(dá)水平（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：芪參六味方可以減輕SHR大鼠心肌纖維化程度，改善心臟舒張功能，其作用機(jī)制可能與抑制EndMT有關(guān)。

關(guān)鍵詞 高血壓；芪參六味方；心肌纖維化；內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；機(jī)制；氣血；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.009

Mechanism of Qishen Liuwei Formula in Inhibiting Endothelial-mesenchymal Transition to Improve Myocardial Fibrosis in Spontaneously Hypertensive Rats

HUANG Lijun， DONG Fei， GAO Qun， JIA Wenhao， XIAO Huali， YU Linbo， MAO Tianshi， HUI Yanran， LIN Qian， ZHOU Kun

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Corresponding Author ZHOU Kun， E-mail： dfzhk@126.com

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Qishen Liuwei Formula on myocardial fibrosis in spontaneously hypertensive rats.Methods：The spontaneously hypertensive rat（SHR） model was used，and the rats were divided into model group，low concentration group，high concentration group and Western medicine group，and Wistar-Kyoto（WKY） rats of the same age were used as control group，with 6 rats in each group.After 12 weeks of intervention，the cardiac function was monitored，and systolic function index such as left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short axis shortening rate（LVFS），and diastolic function index（early diastolic blood flow velocity（E） and mitral ring motion amplitude（E′） were calculated.After 12 weeks of intervention，the rats were executed，the left ventricular myocardial tissue was extracted，and the total area of collagen fibers in the myocardium and the area of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen were observed by picrate scarlet staining，and the ratio of the two collagen areas was calculated.Western Blot analysis was performed to detect the fibrination-related indexes type Ⅰ collagen，type Ⅲ collagen，matrix metalloproteinase 9（MMP-9），matrix metalloproteinase inhibitor 1（TIMP-1），endothelial-mesenchymal transition（EndMT）-associated platelet-vascular endothelial adhesion molecule（CD31），vascular endothelial-calcium-adhesion protein（VE-Cadherin），α-smooth muscle actin（α-SMA），human fibroblast specific protein 1（FSP1）.The mRNA levels of CD31，VE-Cadherin，α-SMA and FSP1 of EndMT were detected by Real-time fluorescence quantification（qPCR）.Result：After 12 weeks of intervention，compared with the control group，the expression of MMP-9 protein of myocardial tissue deceased in the traditional Chinese medicine group（P＜0.05），the levels of myocardial interstitial type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen deceased（P＜0.01），the diastolic function E/E′ of rat heart improved（P＜0.01），and the protein levels of EndMT-related proteins α-SMA，F(xiàn)SP1 and the mRNA levels of VE-Cadherin，α-SMA mRNA deceased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Qishen Liuwei Formula could reduce the degree of myocardial fibrosis and improve the diastolic function in SHR rats，and its mechanism might be related to the inhibition of EndMT.

Keywords hypertension; Qishen Liuwei Formula; myocardial fibrosis; endothelium-mesenchymal transition; mechanism; qi and blood; experimental study

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.81874385）

作者單位 1.北京中醫(yī)藥大學(xué)（北京100029）；2.北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院；5.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院新疆兵團(tuán)阿拉爾醫(yī)院；6.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院（北京100078）

通訊作者 周鹍，E-mail：dfzhk@126.com

引用信息 黃麗君，董菲，高群，等.芪參六味方抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（3）：452-458.

我國高血壓患病率仍呈上升趨勢，據(jù)報(bào)道，截至2018年我國成人高血壓患病率為27.5%^［1］。高血壓起病大多隱匿，檢出時(shí)可能已合并有心、腦、腎、血管等靶器官損害，嚴(yán)重影響病人預(yù)后，且造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，在加強(qiáng)血壓管理的同時(shí)，干預(yù)高血壓引起的靶器官損害十分必要。心肌纖維化是高血壓引起的心臟損害的常見病理表現(xiàn)形式，與心臟重構(gòu)有著本質(zhì)聯(lián)系，嚴(yán)重影響心臟彈性，是高血壓發(fā)展至心臟舒張功能障礙甚至是舒張性心力衰竭的必經(jīng)病理環(huán)節(jié)^［2-3］。心臟間質(zhì)中過度沉積的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）是心肌纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)，其主要成分由心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFBs）分泌，而內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）是CFBs的重要來源^［4］。所以抑制EndMT，從而減少CFBs和ECM數(shù)量，是抑制心肌纖維化的重要途徑，有利于保護(hù)正常心肌結(jié)構(gòu)，改善心臟功能，延緩心血管疾病進(jìn)展。然而目前并無特定的抗纖維化治療方法，中醫(yī)藥治療成為一種新思路。

芪參六味方是基于中醫(yī)氣血理論并結(jié)合心肌纖維化中醫(yī)病機(jī)所創(chuàng)，具有益氣活血、補(bǔ)益肝腎的功效。有研究團(tuán)隊(duì)前期通過橫斷面調(diào)查證實(shí)，高血壓與心臟舒張功能減低緊密相關(guān)，且氣虛血瘀證是高血壓舒張功能障礙病人的常見證型^［5］。通過隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明了芪參六味方可以改善高血壓病人的心臟舒張功能^［6］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了方中組成藥物可以通過改善心肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)從根本上改善心臟舒張功能并逆轉(zhuǎn)心室重塑^［7］。本研究旨在進(jìn)一步探討芪參六味方是否通過抑制EndMT改善心肌纖維化，從而發(fā)揮改善心臟舒張功能的作用，為臨床干預(yù)心肌纖維化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）24只，同齡雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6只，無特定病原體（SPF）級(jí)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕，大鼠專用無菌飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本動(dòng)物研究方案已經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物研究內(nèi)容及過程均符合國家對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

芪參六味方配方顆粒，原方飲片組成：生黃芪30 g，丹參30 g，熟地黃15 g，三七10 g，川芎30 g，山茱萸10 g，茯苓10 g，澤瀉15 g，夏枯草10 g，益母草15 g，葛根30 g。按原方比例配制顆粒劑，購自北京康仁堂公司，臨用使用無菌蒸餾水溶解。氯沙坦鉀片（規(guī)格：每片50 mg，1盒7片，Merck Sharp Dohme Limited公司生產(chǎn)，批號(hào)：J20180054）臨用研磨并使用無菌蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑與儀器

RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：R0020）、30%丙烯酰胺（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：A1010）、1 mol Tris-HCL（pH 6.8）（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：T1020）、1.5 mol Tris-HCL（pH 8.8）（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：T1010）、4×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，型號(hào)：P1016）、實(shí)時(shí)熒光定量（PCR）引物（北京Invitrogen公司）、預(yù)染蛋白marker（美國thermo公司，批號(hào)：26616）、聚偏乙烯（PVDF）膜（美國MILLPORE公司，批號(hào)：IPVH00010）、天狼星紅染色試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：E411-04）、一抗GAPDH（美國bioworld公司，批號(hào)：AP0063）、二抗（美國KPL公司，批號(hào)：074-1506）。

小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測儀（美國Visual Sonics公司，型號(hào)：Vevo770）、 QL-902型號(hào)渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-902）、離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號(hào)：Centrifuge 5415D）、分光光度計(jì)（美國Therno scientific公司，型號(hào)：NANODROP 2000）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon 1600）、熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號(hào)：ABI7500）；電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）。

1.4 分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將24只SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥低濃度組、中藥高濃度組、西藥組，每組6只，6只WKY大鼠作為對(duì)照組。各組給予相應(yīng)藥液灌胃12周。模型組與對(duì)照組給予無菌蒸餾水；中藥低濃度組給予相當(dāng)于生藥量17.08 g/（kg·d）的配方顆粒溶液（相當(dāng)于臨床劑量的一半）；中藥高濃度組給予相當(dāng)于生藥量34.16 g/（kg·d）的配方顆粒溶液（相當(dāng)于臨床劑量）；西藥組給予氯沙坦鉀片8.33 mg/（kg·d）（相當(dāng)于臨床劑量50 mg/d）。

1.5 超聲心動(dòng)檢測

給藥12周后，將大鼠脫毛，使用2%異氟烷麻醉大鼠，控制大鼠心室率在300～350次/min，然后使用Vevo770型小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測儀采集相關(guān)指標(biāo)。將探頭置于大鼠胸骨旁短軸切面乳頭肌水平，測量左心室舒張末期內(nèi)徑與左心室收縮末期內(nèi)徑，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）與左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）；然后切換到心尖四腔心切面，將取樣容積置于二尖瓣瓣口，測量舒張?jiān)缙诳缍獍暄魉俣龋‥）與舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)運(yùn)動(dòng)幅度（E′），并計(jì)算E/E′值，每個(gè)參數(shù)重復(fù)測量3次取平均值。

1.6 左室心肌組織病理形態(tài)

頸椎脫臼處死大鼠后迅速取出大鼠心臟，分離出完整左心室凍存?zhèn)溆谩Ｈ龃娴男募〗M織，于4%甲醛溶液中浸泡固定48 h后，使用石蠟包埋切片，選取合格的切片進(jìn)行苦味酸-天狼猩紅染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察切片中呈紅色的膠原纖維含量及分布；在偏光顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原各自的含量及分布，利用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測量兩種膠原纖維的面積，并計(jì)算Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原面積比值。

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

RIPA裂解液提取心肌組織中總蛋白，制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳；將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫下封閉1 h，加入一抗工作液在4 ℃條件下反應(yīng)過夜；酸性磷酸酶抗體（TBST）洗膜后加入二抗工作液，室溫孵育1 h，再次洗膜；加入ECL發(fā)光液顯影；UVP凝膠成像分析系統(tǒng)分析Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）與內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）相關(guān)指標(biāo)血小板-血管內(nèi)皮黏附分子（CD31）、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、人成纖維細(xì)胞特異蛋白1（FSP1）條帶的灰度值。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測心肌組織中EndMT相關(guān)mRNA的表達(dá)

取凍存的大鼠左心室心肌組織，按照Trizol試劑說明書提取心肌組織中的總RNA，用分光光度計(jì)檢測純度及含量；參照Real-Time PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加入相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增；將所有擴(kuò)增后的cDNA樣品分別配置RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)；采用2^{－△△ Ct}法分析CD31、VE-Cadherin、α-SMA、FSP1 mRNA的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)所涉及心功能指標(biāo)、Ⅰ型/Ⅲ型膠原面積比值、纖維化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平、EndMT相關(guān)蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平等符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x^-±s）表示。經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，且均方差齊，故多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)心功能的影響

給藥12周后，各組LVEF比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，模型組LVFS下降（P＜0.05）；與模型組相比，中藥低濃度組、中藥高濃度組、西藥組LVFS比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，模型組大鼠E/E′明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥低濃度組E/E′下降（P＜0.05），中藥高濃度組、西藥組E/E′ 明顯下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，SHR大鼠心臟收縮和舒張功能都有所減低，但以舒張功能減低為主，而芪參六味方可以改善SHR大鼠心臟舒張功能，給予高濃度時(shí)作用更顯著。詳見表1。

2.2 對(duì)心肌組織膠原纖維含量的影響

2.2.1 普通光鏡下觀察苦味酸-天狼星紅染色切片

經(jīng)苦味酸-天狼星紅染色后膠原纖維在普通光鏡下觀察呈紅色，心肌細(xì)胞呈黃色。對(duì)照組心肌間質(zhì)中膠原纖維含量較少，且排列均勻；與對(duì)照組相比，模型組膠原纖維含量明顯增多，且排列紊亂；與模型組相比，中藥低濃度組、中藥高濃度組、西藥組膠原纖維含量均減少，分布較均勻，其中中藥高濃度組膠原纖維含量最少。說明SHR大鼠心肌組織存在膠原纖維增多即纖維化現(xiàn)象，而芪參六味方可以改善其膠原纖維沉積，且高濃度作用更顯著。詳見圖1。

2.2.2 偏光顯微鏡下觀察Ⅰ型與Ⅲ型膠原分布并計(jì)算二者面積比值

在偏光顯微鏡下，可以清晰顯示Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，Ⅰ型膠原纖維排列緊密，呈橙黃色或亮紅色，Ⅲ型膠原纖維呈綠色。對(duì)照組中膠原纖維含量較少，排列均勻；與對(duì)照組相比，模型組膠原纖維面積明顯增大，以Ⅰ型膠原纖維為主；與模型組相比，中藥低濃度組、中藥高濃度組、西藥組膠原纖維面積均減小。Ⅰ型與Ⅲ型膠原面積比值：與對(duì)照組相比，模型組比值顯著增大（P＜0.05）；與模型組相比，中藥高濃度組、西藥組比值下降（P＜0.05），中藥低濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，高濃度芪參六味方可以減少SHR大鼠心肌組織中膠原纖維沉積，且以減少Ⅰ型膠原為主。詳見圖2及表2。

基于以上結(jié)果，芪參六味方高濃度組改善SHR大鼠心功能、減少膠原纖維沉積的作用明顯優(yōu)于低濃度組，故后續(xù)檢測心肌組織中蛋白及mRNA表達(dá)時(shí)均保留芪參六味方高濃度組，舍棄低濃度組。

2.3 Western Blot法檢測大鼠心肌組織中蛋白表達(dá)水平

2.3.1 心肌纖維化相關(guān)蛋白Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平

ECM降解與沉積的動(dòng)態(tài)平衡主要由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）共同調(diào)節(jié)，二者比例失調(diào)則會(huì)促進(jìn)心肌纖維化。與對(duì)照組相比，模型組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，中藥高濃度組與西藥組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)量均顯著下降（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，模型組MMP-9表達(dá)量增加（P＜0.01），TIMP-1表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組相比，中藥高濃度組MMP-9表達(dá)量下降（P＜0.05），TIMP-1表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，西藥組MMP-9表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TIMP-1表達(dá)量增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，芪參六味方可以降低SHR大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9的表達(dá)，減輕心肌纖維化程度。詳見圖3及表3。

2.3.2 EndMT相關(guān)蛋白CD31、VE-Cadherin、α-SMA、FSP1表達(dá)水平

CD31、VE-Cadherin為內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白，α-SMA、FSP1為間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，EndMT表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物減少，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加。與對(duì)照組相比，模型組VE-Cadherin表達(dá)明顯下降（P＜0.01），α-SMA、FSP1表達(dá)增加（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，西藥組VE-Cadherin表達(dá)增加（P＜0.05），中藥高濃度組與西藥組干預(yù)后α-SMA表達(dá)均下降（P＜0.05）、FSP1表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）；各組CD31表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，芪參六味方可以增加內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)降低間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，即抑制EndMT進(jìn)程。詳見圖4及表4。

2.4 qRT-PCR法檢測大鼠心肌組織EndMT相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，模型組CD31與VE-Cadherin mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高濃度組與西藥組VE-Cadherin mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01），而CD31 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但中藥高濃度組有增加趨勢（P＝0.065）。與對(duì)照組相比，模型組α-SMA mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)SP1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組相比，中藥高濃度組與西藥組干預(yù)后α-SMA mRNA均顯著下降（P＜0.01），西藥組FSP1 mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），中藥高濃度組有下降趨勢（P＝0.07）。結(jié)果表明，芪參六味方可以增加內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)，降低間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)，具有抑制EndMT的作用。詳見表5。

3 討 論

芪參六味方來源于臨床治療高血壓的有效方劑補(bǔ)腎降壓方，該方由經(jīng)典名方六味地黃丸結(jié)合知名專家劉渡舟治療高血壓的三草湯^［8］化裁而來。目前普遍認(rèn)為肝腎不足是高血壓病的發(fā)病基礎(chǔ)^［9］，而團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)高血壓合并舒張功能障礙病人常見氣虛血瘀證^［5］，基于此，本團(tuán)隊(duì)通過隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)了在補(bǔ)腎降壓方的基礎(chǔ)上加用生黃芪、三七、川芎等益氣活血藥物有利于改善病人的心臟舒張功能^［6］，且療效優(yōu)于單用補(bǔ)腎降壓方^［10］，由此形成芪參六味方。中醫(yī)理論認(rèn)為氣與血是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的兩大基本物質(zhì)，是人體生命活動(dòng)能力的集中體現(xiàn)，二者相互依存，其中氣起主導(dǎo)作用，《血證論》有言：“夫載氣者，血也；而運(yùn)血者，氣也。人之生也，全賴乎氣”。《素問》言：“心主身之血脈”，心氣是推動(dòng)血液循行的基本動(dòng)力，心氣的強(qiáng)弱在血液循行中起著十分關(guān)鍵的作用，心氣虛者，常因運(yùn)血無力，血行遲滯，而產(chǎn)生心脈瘀阻。血能載氣，氣存于血中，賴血之運(yùn)載而達(dá)全身，若血行不暢，則反過來加重氣虛。有學(xué)者認(rèn)為氣虛是心肌纖維化的始動(dòng)因素，心肌纖維化形成的機(jī)制亦與中醫(yī)“心氣虛，無力鼓動(dòng)氣血”的病機(jī)相似^［11］。而研究表明，益氣活血藥可改善舒張性心力衰竭大鼠的心臟舒張功能，且重用益氣藥時(shí)療效更佳^［7］。李輝等^［12］證實(shí)以益氣活血、補(bǔ)肝溫腎為主要功效的參鹿寧心湯可延緩頑固性心力衰竭病人的心肌重塑，與抑制心肌纖維化有關(guān)。

心肌纖維化可由心臟壓力超負(fù)荷、心肌持續(xù)或反復(fù)缺血缺氧等導(dǎo)致，被稱為反應(yīng)性纖維化，表現(xiàn)為心臟間質(zhì)和血管周圍膠原增多，心肌僵硬度增加而順應(yīng)性下降^［13］。高血壓可直接造成左心室代償性向心性重構(gòu)，心肌壁僵硬，心室容量減少，出現(xiàn)左心室在舒張期充盈受損、舒張末壓增高，進(jìn)而發(fā)生心力衰竭，心肌纖維化是該過程的病理基礎(chǔ)^［14］。E/E′比值與舒張功能減退程度呈正相關(guān)，E/E′≥8提示存在舒張功能障礙^［15］。ECM是心肌纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)，Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡(luò)的主要成分，Ⅰ型膠原決定心肌的硬度，Ⅲ型膠原決定心肌的彈性，心肌組織Ⅰ型與Ⅲ型膠原比值增加即說明出現(xiàn)纖維化趨勢。ECM的降解主要由MMPs調(diào)節(jié)，TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，二者比例失調(diào)可導(dǎo)致ECM代謝紊亂，促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)程^［16］。ECM過度沉積由成纖維細(xì)胞介導(dǎo)，EndMT是人體募集成纖維細(xì)胞的重要途徑，約有27%～33%的成纖維細(xì)胞來源于EndMT，壓力負(fù)荷過重、缺氧等多種損傷因素可以誘導(dǎo)這一過程，從而增加成纖維細(xì)胞數(shù)量和ECM分泌^［4］。EndMT是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)皮遷移過程，內(nèi)皮細(xì)胞從內(nèi)皮分離，并在不同程度上減少內(nèi)皮特性而獲得間充質(zhì)特性，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物如CD31、VE-Cadherin減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如FSP1、α-SMA增加^［17-18］。

抑制EndMT成為減輕心肌纖維化、保護(hù)心功能、延緩心血管疾病進(jìn)程的重要途徑，然而目前尚且缺乏有效的臨床干預(yù)手段。本研究以20周齡SHR大鼠建立高血壓心肌纖維化模型^［19］，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，模型組大鼠較對(duì)照組E/E′ 升高、心肌組織中膠原面積擴(kuò)大、Ⅰ型/Ⅲ型膠原面積比值增加，且Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，提示模型組大鼠存在心肌纖維化；而心肌組織CD31蛋白表達(dá)、VE-Cadherin蛋白及mRNA表達(dá)減少，F(xiàn)SP1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)增加，提示模型組大鼠存在EndMT。芪參六味方干預(yù)后，E/E′下降，膠原面積明顯縮小，Ⅰ型/Ⅲ型膠原面積比值下降，而Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白表達(dá)減少，證實(shí)該方可以降低心肌間質(zhì)中膠原纖維含量并改變其成分占比，從而減輕心肌纖維化，改善心臟舒張功能；且芪參六味方可以增加VE-Cadherin蛋白及mRNA表達(dá)，而降低FSP1與α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)，說明該方抑制EndMT作用明確。由此提出，芪參六味方具有抑制心肌纖維化、改善心臟舒張功能的作用，且作用機(jī)制可能與抑制EndMT有關(guān)。

4 小 結(jié)

綜上所述，高血壓造成的一系列靶器官損害是影響病人生存質(zhì)量和預(yù)后的關(guān)鍵，其中以心臟損害首當(dāng)其沖，而心肌纖維化是其主要表現(xiàn)形式。因此，延緩甚至逆轉(zhuǎn)靶器官損傷是高血壓治療過程中不可缺少的一環(huán)，然而目前并無有效的干預(yù)措施。總結(jié)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀是高血壓心肌纖維化的關(guān)鍵病機(jī)，芪參六味方具有益氣活血化瘀、補(bǔ)益肝腎的功效，符合高血壓心肌纖維化的中醫(yī)病機(jī)。本研究立足于高血壓心肌纖維化的基本中醫(yī)病機(jī)，結(jié)合現(xiàn)代基礎(chǔ)研究成果，從EndMT出發(fā)，證實(shí)了芪參六味方可以通過抑制EndMT，調(diào)整MMP-9與TIMP-1比例，減輕心肌間質(zhì)中膠原纖維沉積，調(diào)整膠原成分占比，改善心肌纖維化，最終改善心臟功能、保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)，對(duì)高血壓引發(fā)的心肌纖維化有良好的干預(yù)作用。

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（收稿日期：2022-11-11）

（本文編輯 王雅潔）