基于LNA-TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測技術的藥用黃精摻偽研究△

王多梅，胡沖，2a，蒲婧哲，2，陳靈麗，2，楊建波，2，3，張亞中，2*，張文娟

1.安徽省食品藥品檢驗研究院 藥品檢驗研究所，安徽 合肥 230051；2.國家藥品監督管理局 中藥質量研究與評價重點實驗室，安徽 合肥 230051；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

黃精是一種藥食同源的中藥資源[1-2]，具有提高機體免疫力[3]、降血糖、調血脂[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗菌[8]、抗病毒[9]等藥理作用，其在新藥研制和保健品開發等方面具有廣闊的發展前景。我國黃精種質資源多樣，有黃精屬植物30 余種。《中華人民共和國藥典》2020 年版規定藥用黃精的基原為百合科植物黃精Polygonatum sibiricumDelar.ex Redoute、多花黃精P.cyrtonemaHua 和滇黃精P.kingianumColl.et Hemsl的干燥根莖[10]。然而，歷代本草記載的藥用黃精來源包括多種黃精屬植物的根狀莖，湖北黃精P.zanlanscianensePamp 作為民間習用中藥，也被記載在本草典籍中[11]。湖北黃精的根莖具有潤肺滋陰、補脾益腎之功效，可用于治療體虛乏力、心悸氣短、肺燥干咳、糖尿病等多種疾病。因此，市場上將湖北黃精的干燥根莖混淆為黃精的現象較為普遍。而摻假手段也并非完全替代使用，而是在黃精基原藥材中摻有少量的湖北黃精或者其他黃精。現有技術仍無法解決此類摻假的定量檢測問題。

形態學特征是進行黃精基原植物分類的主要依據。黃精根莖為結節狀或連珠狀膨大，但由于生長環境、氣候條件、土壤養分及生長年限等因素的影響，即使同一種黃精生長在不同地區其形態特征也會存在一定差異，因此形態鑒別的手段往往缺乏準確性。此外，黃精屬植物的顯微特征及化學成分相似度極高，這使黃精屬植物的物種判別缺乏特異性。

鑒于黃精屬植物形態特征鑒別的局限性，分子鑒定技術被用于黃精屬植物的親緣關系研究、種質資源鑒別和遺傳多樣性分析[12-16]。其中鎖核酸（LNA）-TaqMan 探針是在TaqMan 探針的基礎上選擇性對探針中的部分堿基修飾成LNA 堿基，修飾后的核糖2′-O位和4′-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋[17-18]，并連接成環形，以此提高探針與目標序列之間的親和力、特異性和靈敏度的方法[19-20]，是目前公認的用于基因表達水平分析的重要方法，在生物醫藥領域得到廣泛應用[21-25]。本研究應用LNA-TaqMan實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測藥用黃精中湖北黃精的摻偽比例，建立相關的摻偽檢測方法，為黃精的質量監管和研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Xinyi-48 型高通量組織研磨儀（寧波新藝超聲設備有限公司）；HC-2066 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；C1000 Thermal Cycler CFX96 型熒光定量PCR 儀、CXF96 Optics ModuleI型凝膠成像儀、164-5050 型基礎電泳儀、170-4486型水平電泳槽均購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；ME204 型分析天平 [梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]；NanoDrop One型超微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

植物基因組DNA 提取試劑盒 [天根生化科技（北 京）有 限公 司]；2×M5 Super FastTaqPCR MasterMix（北京聚合美生物科技有限公司）；ExTaq? Version 2.0、瓊脂糖均購于寶日醫生物技術（北京）有限公司；4S GelRed 核酸染料、DL2000 DNA Marker、引物均購于生工生物（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 樣品

黃精Polygonatum sibiricumDelar.ex Redoute、多花黃精P.cyrtonemaHua、滇黃精P.kingianumColl.et Hemsl.、湖北黃精P.zanlanscianensePamp.共計34 份樣品由安徽中醫藥大學楊青山副教授鑒定其基原。樣品保存于安徽省食品藥品檢驗研究院，具體信息見表1。

表1 黃精樣品信息

2 方法

2.1 引物和探針的設計與合成

從美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載多花黃精、黃精、滇黃精、湖北黃精的trnC-petN序列，通過序列比對分析，以101 位的胞嘧啶（C）＞腺嘌呤（A）突變作為單核苷酸多態性（SNP）位點，結合Beacon Designer 8 軟件分析并獲得湖北黃精特異性探針。探針經過高效液相色譜法（HPLC）純化，5＇端標記熒光素基團FAM，3＇端標記非熒光素猝滅基團BHQ1，序列為5＇-FAM-attttGatAacAcaTggc-BHQ1-3＇（小寫字母表示LNA 修飾堿基）。同時利用Primer 3.0 軟件設計湖北黃精特異性引物對，通過NCBI 數據庫進行BLAST 同源性比對驗證后，由生工生物（上海）股份有限公司合成。引物序列為Forward Primer：5＇-CAGAGGCAA AGGACTAAG-3＇；Reverse Primer：5＇-TCCCTATTG ATACCGATTTG-3＇。

2.2 DNA提取與模板制備

取根莖或葉片樣品，用75%乙醇1 mL、滅菌超純水清洗，吸干表面水分，新鮮樣品置40 ℃烘箱中低溫烘干水分，取約0.1 g，置球磨儀中研磨成細粉。稱取20 mg，置1.5 mL 離心管中，用植物基因組DNA 提取試劑盒進行核酸提取，獲得DNA 模板，利用超微量分光光度計測量模板DNA 濃度及純度，-20 ℃保存備用。

2.3 實時熒光定量PCR反應條件優化

選取湖北黃精、多花黃精、黃精、滇黃精樣品各2批，對實時熒光定量PCR條件進行優化，總反應體積為20 μL，包括PCR 反應混合液（2×）10 μL、上下游引物及探針（10 μmol·L-1）、模板DNA 1 μL。分別對體系中引物及探針的濃度及退火溫度（Tm）進行反應條件優化，篩選出最佳組合條件。其中引物濃度為0.1～1.0 μmol·L-1、探針濃度為0.1～0.5 μmol·L-1，兩者濃度配比篩選出最佳濃度組合；Tm值為52～62 ℃，進行梯度擴增，根據實時熒光定量PCR 擴增曲線臨界循環數（Ct）值及擴增曲線形狀篩選并確定最佳Tm。

2.4 專屬性試驗

用2.1項下實時熒光定量PCR引物及探針對表1中湖北黃精、黃精、多花黃精、滇黃精進行擴增反應，以無菌超純水為空白對照，檢驗引物及探針的專屬性。

2.5 適用性試驗

用2.1 項下實時熒光定量PCR 探針及引物對不同產地和來源的10 批湖北黃精進行測試，檢驗反應體系的適用性。

2.6 重復性及精密度試驗

對同一樣品（編號：HBHJ-01）重復測定3 次，每次試驗記錄Ct值，分析組內Ct值變異系數，檢測方法的重復性。同時平行測定同一批次湖北黃精（編號：HBHJ-01）樣品5 份，標記1～5，記錄Ct值，分析組內Ct值變異系數，進行方法精密度考察。

2.7 湖北黃精摻偽程度檢測

分別取湖北黃精（編號：HBHJ-01）與多花黃精（DHHJ-01）細粉，按照表2 混合成不同摻偽比例樣品，利用優化后的PCR 擴增條件進行擴增，記錄不同濃度下擴增曲線Ct值大小，鑒于PCR 呈指數擴增，達到閾值時的擴增輪數為Ct值：標準品（S）與供試品（T）的Ct值之差用ΔCt表示，則樣品中的目的DNA 所占比例可用2-ΔCt×100%表示，計算值與期望值比例的百分比作為回收率。本研究中S 為湖北黃精，T為不同摻偽比例樣品。

表2 湖北黃精和多花黃精摻偽比例

3 結果

3.1 引物、探針濃度的確定

以湖北黃精DNA 作為模板，選擇以引物濃度為0.4 μmol·L-1，探針濃度分別為0.10、0.20、0.30、0.40、0.45、0.50 μmol·L-1進行實時熒光定量PCR，并記錄擴增曲線Ct值，結果顯示探針終濃度為0.3 μmol·L-1時Ct值最小，且可獲得典型的S 形擴增曲線；選擇探針濃度為0.3 μmol·L-1，引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol·L-1進行實時熒光定量PCR，并記錄擴增曲線Ct值，結果顯示引物終濃度為0.4 μmol·L-1時Ct值最小。綜上所述，選探針終濃度為0.3 μmol·L-1、引物終濃度為0.4 μmol·L-1為最佳組合濃度。

3.2 退火溫度考察結果

梯度擴增結果表明，當退火溫度高于62 ℃時，定量PCR 擴增曲線平坦，未出現典型的S 形擴增曲線；退火溫度為58～60 ℃時，均可獲得較好的擴增曲線，且58 ℃時曲線線形最好；溫度低于58 ℃時，出現非特異性擴增。因此，最終確定退火溫度為58 ℃。

3.3 實時熒光定量PCR優化最終條件

優化后的反應總體系為20 μL，其中包括Premix ExTaq（2×）10 μL、上下游引物（20 μmol·L-1）各0.4 μL、LNA-TaqMan探針（20 μmol·L-1）0.3 μL、模板DNA 2 μL、無菌超純水補足。反應程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃30 s，共進行40個循環。

3.4 專屬性試驗結果

對表1中湖北黃精、黃精、多花黃精、滇黃精進行擴增反應結果表明，僅湖北黃精的DNA 有典型的S 形擴增曲線，而黃精、多花黃精、滇黃精的DNA均未出現擴增現象，表明引物和探針有較好的專屬性。不同種黃精部分樣品的典型擴增曲線見圖1。

圖1 不同種黃精部分樣品的實時熒光定量PCR典型擴增曲線

3.5 適用性試驗結果

取不同產地和來源的10 批湖北黃精按照上述體系測定。結果顯示，所有湖北黃精樣品均為陽性擴增，樣品Ct值為20.380～22.454（表3），均值為21.502，SD為0.66，表明方法有較好的適用性。

表3 不同種黃精部分樣品的熒光定量PCR適用性實驗Ct值（n=3）

3.6 重復性及精密度試驗結果

按照上述體系重復測定同一樣品3 次，結果顯示，Ct值分別為20.380、21.013、21.628，均值為21.007，SD 為0.62，組內Ct值變異系數為0.30。表明該方法重復性較好。同時，同一批的5 份湖北黃精樣品Ct值分別為20.931、21.638、22.070、22.454、21.332，平均Ct值為21.685，組內Ct值變異系數為0.28。表明該方法精密度較好。

3.7 湖北黃精摻偽程度檢測

不同比例混合樣品經過上述體系進行實時熒光定量PCR 擴增后，經ΔCt值計算得到的相應的混合樣品摻偽比例見表4。計算所得摻偽比例與實際湖北黃精含有量相近，回收率為80.72%～126.13%。結果顯示，該方法在湖北黃精摻偽1%時，仍可穩定檢出。

表4 不同比例混合黃精樣品的摻偽程度檢測結果

4 討論

黃精作為藥食同源的中藥資源，市場需求量大，發展前景廣闊。目前藥用黃精的鑒別方法主要是化學成分研究，而黃精塊莖作為其藥食同源的主要部位，均為結節狀或連珠狀膨大，其顯微特征也極為相似，成分相似度極高，傳統鑒定方法容易受人為或環境因素的影響。因此，建立一種能夠快速、準確的藥用黃精摻偽定量檢測方法尤為重要。

隨著中藥檢測技術的發展與檢測要求的提高，分子鑒定方法在中藥鑒定領域的運用越來越多。目前，運用實時熒光定量PCR 及數字化PCR（dPCR）技術可以實現對檢測成分的相對定量甚至絕對定量[26-27]。其中實時熒光定量PCR 具有高效率、高靈敏度、重復度好的優點，目前是公認的用于基因表達水平分析的重要方法[28-29]，已經開始逐步運用于藥品檢驗領域[30-31]。但在藥用黃精真偽性鑒定上并無相關報道。

本研究利用基于LNA-TaqMan 探針的實時熒光定量PCR 法實現對藥用黃精摻偽湖北黃精的相對定量檢測，利用湖北黃精與藥用黃精葉綠體DNA 中trnC-petN基因間隔區序列差異設計特異性引物及LNA-TaqMan 探針，建立了實時熒光定量PCR 檢測湖北黃精摻偽比例的方法。該方法相較于傳統的熒光定量方法，引入了新型的核酸類似物LNA。利用設計的引物及探針測定不同混合比例湖北黃精摻偽樣品，得到Ct值，通過樣品與湖北黃精陽性擴增樣品間ΔCt值計算，即可檢測湖北黃精摻偽程度，在湖北黃精摻偽1%時仍可穩定檢出，無需進行酶切或者電泳，極大減少了檢驗工作量，同時提高檢測的準確度，縮短了檢測時間，解決了化學檢測手段難以鑒定摻偽比例的難題。本研究的方法能將湖北黃精與藥用黃精有效區分，可為湖北黃精摻偽藥用黃精定量檢測提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。