雷公藤藥蠟對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕的影響*

彭柳瑩，馮小可，錢晨

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、漸進(jìn)性、反復(fù)發(fā)作，涉及多關(guān)節(jié)的炎癥性自身免疫疾病，其病理特征為滑膜炎，可反復(fù)發(fā)作，破壞關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙［1］，主要癥狀是全身關(guān)節(jié)游走性紅腫、疼痛，并伴有輕、中度不規(guī)則發(fā)熱［2］。RA患者的關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞，即骨侵蝕的發(fā)生是由于破骨細(xì)胞的過(guò)度活化，造成成骨細(xì)胞的骨形成作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用失衡導(dǎo)致的。RA的臨床常用藥主要有非甾體抗炎藥、生物制劑、鎮(zhèn)痛藥、抗風(fēng)濕藥及激素等，但均有胃部不適、肝損傷、腎毒性、影響內(nèi)分泌系統(tǒng)等較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)［3］。現(xiàn)代研究表明，雷公藤具有免疫調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎殺菌及抗腫瘤的作用，也是目前治療RA廣泛認(rèn)可的單味中藥［4］，但其毒性作用又與劑量成正比。如何對(duì)其減毒增效，使其具有更廣闊的臨床應(yīng)用空間，是一直以來(lái)的研究重點(diǎn)。本研究以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠為研究對(duì)象，觀察雷公藤藥蠟對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)DBA/1J雄性小鼠32只，體質(zhì)量（20±5）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0356440。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房保持室溫21～23 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，光照時(shí)間8∶00～20∶00，自由飲水及進(jìn)食。所有研究均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理指南的原則，并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：IACUC-1803012）。

1.2 藥物及試劑 中藥雷公藤購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房（江陰天江藥業(yè)有限公司）。雷公藤藥蠟制備及方法：中藥雷公藤打成細(xì)粉，與水以一定比例調(diào)勻，制藥泥備用。

牛Ⅱ型膠原CⅡ（Thermo Fisher Scientific，批號(hào)：20021）；完全弗氏佐劑CFA、不完全弗氏佐劑IFA（Thermo Fisher Scientific，批號(hào)：F5881）；小鼠MIP-2 ELISA Kit（Abcam，批號(hào)：ab204517）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qia-gen，批號(hào)：205111）；引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 E8O8酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-TEK Instruments公司）；TSJ-QX型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-A型病理組織包埋冷凍臺(tái)、PHY Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；ABI Prism 7900HT型PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）SYBR Green Mixture及384孔反應(yīng)板（美國(guó)ABI公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模及分組 CIA小鼠模型制備：1）初次免疫。牛Ⅱ型膠原溶于0.05 M冰醋酸中，濃度4 mg/mL，4 ℃攪拌過(guò)夜。次日，取牛Ⅱ型膠原與等體積完全弗氏佐劑置于冰上乳化。混勻，使用1 mL進(jìn)口螺旋注射器吸取。距小鼠尾根部1.5～2 cm處的尾巴的皮下注射，100 μL/mouse（150 μg/mouse，牛Ⅱ型膠原終濃度1.5 μg/uL）。注意避開(kāi)靜脈。2）加強(qiáng)免疫。初次免疫后第21天：牛Ⅱ型膠原溶于0.05 M冰醋酸中，濃度3 mg/mL，置于4 ℃冰箱攪拌過(guò)夜；牛Ⅱ型膠原與等體積不完全弗氏佐劑冰上乳化，混勻，小鼠尾根部1.5～2 cm處的尾巴的皮下注射，50 μL/mouse（75 μg/mouse，牛Ⅱ型膠原終濃度1.5 μg/μL）。如發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)發(fā)紅、腫脹，甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、活動(dòng)障礙，則表明造模成功。將24只DBA/1J雄性小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為正常組、CIA組、雷公藤藥蠟CIA組。除正常組外，其余各組采用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型。

1.4.2 給藥方法 正常組、CIA組不給藥，雷公藤藥蠟CIA組在第2次免疫開(kāi)始行雷公藤藥蠟治療，每天1次，每次30 min，連續(xù)3周。中藥雷公藤打成細(xì)粉，以1∶5的比例與水調(diào)勻，制藥泥備用。治療時(shí)將小鼠固定于木板上，雷公藤藥泥涂抹于四肢關(guān)節(jié)，石蠟加熱，在石蠟未凝前敷于藥泥上。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 另取8周齡SPF級(jí)DBA/1J雄性小鼠8只，以脫毛膏對(duì)稱性地涂抹于小鼠脊柱兩側(cè)，片刻后用干凈的紗布輕輕擦拭脫落的鼠毛，并以溫水清洗背部脫毛區(qū)的皮膚，避免脫毛膏過(guò)多的殘留，第2天于脫毛區(qū)左側(cè)及小鼠四肢左側(cè)關(guān)節(jié)行雷公藤藥蠟，對(duì)應(yīng)脫毛區(qū)右側(cè)及小鼠四肢右側(cè)關(guān)節(jié)行普通蠟療，每日2次，連續(xù)5天，于除去中藥及蠟殘留后1、6、24 h觀察小鼠皮膚的變化并評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 小鼠一般情況 每天觀察各組小鼠飲食、活動(dòng)及毛發(fā)改變情況。

1.5.3 關(guān)節(jié)炎評(píng)分 小鼠足爪及踝關(guān)節(jié)腫脹度行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。0分：無(wú)紅腫；1分：足小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)、足跖均紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)以下均紅腫；4分：包括踝關(guān)節(jié)全部紅腫。

1.5.4 HE染色組織病理學(xué)觀察 將取下的CIA小鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，剔除關(guān)節(jié)周圍肌肉皮毛及軟組織，并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫鈣、脫水、包埋、切片，依照HE染色步驟進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察踝及足趾關(guān)節(jié)間隙、關(guān)節(jié)周圍炎癥、滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況、血管翳形成及軟骨下骨質(zhì)破壞程度。

1.5.5 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分 0分：沒(méi)有組織病理學(xué)改變；1分：輕微局灶性浸潤(rùn)；2分：中度浸潤(rùn)；3分：嚴(yán)重炎癥浸潤(rùn)，但無(wú)血管翳形成或軟骨損傷；4分：非常嚴(yán)重的浸潤(rùn)，形成血管翳和（或）軟骨、骨侵蝕。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 除去雷公藤藥蠟及普通蠟療后，小鼠給藥背部皮膚及四肢關(guān)節(jié)均出現(xiàn)了發(fā)紅、膚溫升高，但無(wú)腫脹、紅斑，持續(xù)時(shí)間5～15 min；在除去中藥及蠟殘留后1、6、24 h后，小鼠給藥處均未出現(xiàn)水腫、紅斑、皮疹、潰爛等，普通蠟療及雷公藤藥蠟對(duì)小鼠皮膚無(wú)刺激性，而5～15 min的皮膚發(fā)紅現(xiàn)象為蠟療溫度引起的局部皮膚毛細(xì)血管擴(kuò)張，屬正常現(xiàn)象。見(jiàn)表2。

表2 小鼠不同時(shí)間點(diǎn)急性皮膚刺激評(píng)分比較

2.2 一般情況評(píng)估 實(shí)驗(yàn)前小鼠均活潑好動(dòng)，毛色正常，睡眠尚可。加強(qiáng)免疫（免疫第21天）開(kāi)始，CIA組及雷公藤藥蠟CIA組小鼠逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，部分小鼠體質(zhì)量增加不明顯或稍見(jiàn)下降、近尾根部稍見(jiàn)脫毛、毛色稍暗淡，活動(dòng)及飲食減少，正常組小鼠活動(dòng)、飲食及毛色未見(jiàn)明顯變化。初次免疫開(kāi)始到免疫后第7周，正常組體質(zhì)量平穩(wěn)，而CIA組和雷公藤藥蠟CAI組小鼠在免疫第5周開(kāi)始體質(zhì)量略有下降，其中雷公藤藥蠟CAI組下降稍小于CIA組，但是與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化折線圖

2.3 小鼠足爪及踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎評(píng)分 CIA組和雷公藤藥蠟CIA組均在初次免疫第28天關(guān)節(jié)炎評(píng)分開(kāi)始增高，28～31天逐漸增高，32天達(dá)到最高，但是CIA組小鼠較雷公藤藥蠟CIA組增高明顯迅速，且前者之后10天關(guān)節(jié)炎評(píng)分仍保持較高水平，而雷公藤藥蠟CIA組關(guān)節(jié)炎評(píng)分較CIA組降低明顯（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)足爪及踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎評(píng)分折線圖

2.4 組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組小鼠關(guān)節(jié)及其關(guān)節(jié)間隙正常，關(guān)節(jié)軟骨無(wú)明顯破壞，滑膜無(wú)明顯增生，未見(jiàn)血管翳形成和骨質(zhì)破壞。CIA組關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，關(guān)節(jié)明顯破壞，滑膜組織增生，關(guān)節(jié)周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。雷公藤藥蠟CIA組關(guān)節(jié)間隙稍見(jiàn)狹窄，關(guān)節(jié)破壞較CIA組減少，滑膜增生不明顯，關(guān)節(jié)周圍少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)表現(xiàn)（HE，×200）

2.5 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分 CIA組組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于雷公藤藥蠟CIA組（P＜0.0001）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分

3 討論

RA是以滑膜增生、多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，骨與軟骨破壞為主要病理特征的自身免疫系統(tǒng)疾病［5］。RA臨床屬于“痹證”“尪痹”的范疇。《素問(wèn)·痹論篇》指出：“所謂痹者，各以其時(shí)，重感風(fēng)寒濕之氣也。”“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也。”又可因感邪季節(jié)、患病部位和臨床表現(xiàn)而分，如《素問(wèn)·痹論篇》曰：“以冬遇此者為骨痹，以春遇此者為筋痹，以夏遇此者為脈痹，以至陰遇此者為肌痹，以秋遇此者為皮痹。”痹證病因病機(jī)可分虛實(shí)，虛者由于肝腎虧虛，氣血不足，筋骨食養(yǎng)，實(shí)者多因風(fēng)寒濕熱毒等邪侵襲，導(dǎo)致氣血壅塞不通，關(guān)節(jié)、經(jīng)脈、肌肉疼痛腫脹、麻木重著，久之毒邪入骨，痰瘀交結(jié)，造成關(guān)節(jié)畸形。

雷公藤又稱斷腸草、山砒霜、南蛇藤等，其性味苦、辛、涼，有大毒，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、通絡(luò)止痛、活血化瘀、消腫散結(jié)、殺蟲(chóng)止血等功效［6］。研究表明，雷公藤對(duì)緩解患者疼痛、改善患者生活質(zhì)量、延緩病情進(jìn)展等有重要作用［7］。雷公藤能夠廣泛地抑制趨化因子、前炎癥細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等炎性細(xì)胞因子，并能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞［8］，還能抑制外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IgM、IgRF［9］。所以，無(wú)論是雷公藤單藥或是其提取物制劑，均有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛［10-11］作用，常用于治療RA［12］、銀屑病關(guān)節(jié)炎［13］等，也因其具有等抗腫瘤［14］、免疫調(diào)節(jié)［15］等藥理作用，臨床上也用于治療其他免疫性疾病（如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡［16］）、腎炎（如：腎病綜合征［17］、糖尿病腎病［18］、紫癜性腎炎［19］、狼瘡性腎炎［20］）、腫瘤［21-22］及皮膚病［23］等。但是雷公藤中化學(xué)成分復(fù)雜，分離出的生物堿、二萜類、三萜類及苷類物質(zhì)均有一定的毒性，二萜類毒性主要針對(duì)心、肝、骨髓、胃腸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)［24］，生物堿毒性主要損害肝臟及生殖系統(tǒng)［25］。所以對(duì)其減毒增效，使其具有更廣闊的臨床應(yīng)用范圍，是一直以來(lái)的研究重點(diǎn)。

《本草綱目》載：“用蠟二斤，于羅中熔，捏作一兜鍪，勢(shì)可合腦大小，搭頭至額，其病立止也。于破傷風(fēng)濕、暴風(fēng)身冷、腳上凍瘡……均有奇效。”清代徐大椿說(shuō)：“湯藥不足盡病……用膏藥貼之，閉塞其氣，使藥性從毛孔而入其腠理，通經(jīng)活絡(luò)，或提而出之，或攻而散之，較服藥尤為有力。”所以對(duì)于風(fēng)寒濕邪侵襲或氣血運(yùn)行不暢、經(jīng)絡(luò)閉阻不通一類病癥的治療效果尤佳。正如《理瀹駢文》所言：“切于皮膚，徹于肉里，攝入吸氣，融入滲液。”

現(xiàn)代研究表明，中藥蠟療通過(guò)藥物透皮、穴位刺激、溫?zé)嵝?yīng)、機(jī)械壓縮等作用可使機(jī)體組織局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、促進(jìn)血液循環(huán)、加快新陳代謝、緩解肌肉痙攣、減輕炎癥反應(yīng)，而石蠟的可塑性和黏滯性能對(duì)接觸區(qū)域產(chǎn)生機(jī)械壓迫并加強(qiáng)溫?zé)嵝Ч顾幬锛盁嵝?yīng)能更好地滲透入組織，并具有松解粘連、軟化疤痕的作用。

本研究通過(guò)CIA觀察中藥雷公藤藥蠟對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎癥及骨侵蝕的影響發(fā)現(xiàn)，雷公藤藥蠟CIA組關(guān)節(jié)炎評(píng)分較CIA組降低明顯；HE染色提示與CIA小鼠踝關(guān)節(jié)相比，雷公藤藥蠟CIA組關(guān)節(jié)間隙稍見(jiàn)狹窄，關(guān)節(jié)破壞較CIA組減少，滑膜增生不明顯，但關(guān)節(jié)周圍仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分雷公藤藥蠟CIA組組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于CIA組，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，急性皮膚刺激及一般情況評(píng)估均為正常。本研究提示，雷公藤藥蠟?zāi)軌驕p少滑膜組織的增生和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，緩解關(guān)節(jié)的腫脹程度，減少骨質(zhì)的破壞。雷公藤性烈，其藥物滲透能力強(qiáng)，雷公藤藥蠟通過(guò)雷公藤加蠟療的協(xié)同作用直接針對(duì)病變關(guān)節(jié)，可通過(guò)“內(nèi)屬臟腑，外絡(luò)肢節(jié)，溝通表里，貫穿上下”的經(jīng)絡(luò)穴位理論、藥物透皮作用及石蠟自身的疊加作用達(dá)到良好的治療效果。同時(shí)，該療法也避免了口服給藥造成的消化道系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等急慢性中毒反應(yīng)。可見(jiàn)，雷公藤藥蠟不失為一種簡(jiǎn)單、安全、有效的治療RA的方法，也為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)研究基出。但是，RA的發(fā)生包括外邪和內(nèi)虛兩端因素的影響，所以中醫(yī)對(duì)RA的治療不拘于一種藥物或一種治療，更有待于根據(jù)辨證論治開(kāi)展復(fù)方治療及外治聯(lián)合治療，以便更好地發(fā)揮中醫(yī)在治療RA中的優(yōu)勢(shì)，使患者病情早日得到緩解。