基于數據挖掘和網絡藥理學探討葉天士治療胸痹心痛病的用藥規律?

顏夢凡,李鑫輝,劉泳釗,李彩云,蔣 嘯

(湖南中醫藥大學中醫學院,長沙 410208)

葉桂(1667—1746),字天士,號香巖,清代著名醫學家,“溫病四大家”之一。葉天士畢生專注臨床研究,親筆著述的醫案并不多,所傳于世者,多為其門人、后裔纂輯。《葉天士醫學全書》所輯醫書13部,輯錄葉天士對溫病學理論的闡釋及其豐富的臨床經驗,廣泛涉及內、外、婦、兒、五官等各科。

胸痹心痛病是以胸部悶痛、喘息不得臥為主癥的疾病,甚者心痛徹背,背痛徹心[1],屬于西醫所指“冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性心臟病、心絞痛”等范疇[2-3]。東漢張仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》中論述“夫脈當取太過不及,陽微陰弦,即胸痹而痛,所以然者,責其極虛也。今陽虛知在上焦,所以胸痹、心痛者,以其陰弦故也”[4],首次明確胸痹的病名,提出“陽微陰弦”是其基本病機。葉天士對胸痹心痛病的理解是基于張仲景思想的繼承與發展,但因其設“胸痹”“心痛”專篇醫案較少,其余醫案分散,又多伴隨其他癥狀,收集難度較大等原因,鮮少有人系統整理分析葉天士治療胸痹心痛病的醫案,本文將收集整理《葉天士醫學全書》中有關胸痹心痛病的醫案,分析其中用藥規律,期望能從中找出葉天士治療胸痹心痛病特有的學術思想,以啟發現代臨床治療胸痹心痛病遣方用藥的思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源與篩選

本次醫案資料選自中國中醫藥出版社出版、黃志英主編的2015年3月第二版《葉天士醫學全書》[5]中《臨證指南醫案》《種福堂公選醫案》《葉氏醫案存真》《葉天士晚年醫案真本》《眉壽堂方案選存》《未刻本葉天士醫案》。此6本書為數據來源,其中《臨證指南醫案》第十卷為《幼科要略》,未納入數據整理范圍。

從《葉天士醫學全書》中所選的6本書籍共載醫案數千例,按以下納入標準和排除標準篩選,通過手工檢索、錄入、復核的方式,最終篩選出100首符合標準的方劑。

1.2 納入標準

在方劑功效主治中依據檢索詞“胸痹”“心痛”“心痛引背”“背痛徹心”“胸痛”進行檢索;病案中方劑有完整藥物組成;首診與復診處方所屬醫案獨立;重復醫案取一則;劑型包括湯劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑。

1.3 排除標準

檢索詞為“胸痞”“胸脅痛”“胸脘痛”等;藥物羅列不全或未給出完整方劑的醫案;重復醫案。

1.4 數據規范

本次數據整理所選的醫案部分缺乏對方藥名稱的規范化統一,帶有別名、年代和葉天士的學術特色,故參照2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)[6]規范中藥名稱,如“廣皮”規范名稱為“陳皮”,“小茴”規范名稱為“小茴香”,“官桂”規范名稱為“肉桂”,“炒桃仁”規范名稱為“桃仁”等;未標注炮制方法的藥物,皆歸為生品,如“甘草、白芍、半夏”等;對于未列出完整藥物組成的方劑,參照《葉天士醫學全書》中《臨證指南醫案集方》將藥物組成補充完整。

1.5 數據賦值與錄入

數據使用二分類賦值法,運用Excel 2021軟件將出現的中藥列為1,未出現的列為0,構建原始數據庫。參照《中華人民共和國藥典》和“十三五”規劃教材《中藥學》[7],按中藥名稱、藥性、藥味、歸經、功效作為類別收錄整理,存在的計為1,不存在的計為0,建立數據矩陣模型。為保證數據的準確性,此次數據挖掘由2位研究人員進行數據錄入與核對。

1.6 統計方法

采用Microsoft Excel 2021軟件,利用頻次統計方法,對數據庫中高頻中藥(頻次≥8次)名稱,藥性、藥味、歸經和功效等變量分布情況進行統計分析,構建三線表,使用Origin 2022軟件制作相應的頻次雷達圖。

采用SPSS Modeler 18.0軟件的Apriori算法進行關聯規則分析,構建藥物關聯規則網狀圖。

采用SPSS 25.0對高頻中藥進行聚類分析和因子分析,繪制聚類圖并提取載荷較高的公因子。

1.7 網絡藥理學研究

1.7.1 核心藥物組合半夏-生姜-茯苓的活性成分和預測靶點篩選 在BATMAN-TCM[8]網站中分別以“BAN XIA”“SHENG JIANG”“FU LING”為檢索式,調整“Score cutoff=80”“AdjustedP-value=0.05”,獲取每味中藥的活性成分和潛在作用靶點,排除重復靶點。

1.7.2 胸痹心痛病的相關靶點篩選 分別以“angina pectoris”“ischemic heart disease”“coronary heart disease”“chest pain”“heartache”為檢索式,在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)、DrugBank數據庫(https：//www.drugbank.ca/)、OMIM數據庫(https：//www.omim.org/)、TTD數據庫(https：//db.idrblab.net/ttd/)中獲取疾病的相關靶點,合并并刪除重復靶點。

1.7.3 獲取核心藥物組合與疾病的相關靶點 使用Venny2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取核心藥物組合半夏-生姜-茯苓與胸痹心痛病的交集靶點,并繪制韋恩圖。

1.7.4 疾病相關靶點的相互作用和核心靶點的篩選 將1.7.3獲取的交集靶點導入STRING網站(https：//string-db.org),設置生物體是“Homo sapiens”,預測靶蛋白的互作關系(protein-protein interaction,PPI)。通過軟件Cytoscape3.9.1中“Analyze Network”功能對從1.7.3獲得的靶點進行拓撲屬性分析,Degree值取中位數進行可視化展示,尋找核心靶點。

1.7.5 通路富集分析 利用1.7.3獲得的靶點,采用Metascape網站(https：//metascape.org)進行基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析,設置物種為H.sapiens,富集靶點大于3,P<0.01,各取生物過程(biological process,BP),細胞組成(cellular component,CC),分子功能(molecular function,MF)結果的前10位,應用微生信網站(www.bioinformatics.com.cn)做BP、CC、MF三合一圖。以KEGG通路結果的Gene In GO And Hit List降序排列,取前20位,應用微生信網站做富集氣泡圖。

2 結果

收錄的6本醫籍中符合標準的處方共100首,涉及中藥169味,中藥使用總頻次為655次。其中,茯苓的使用頻次為45次,是使用頻次最高的藥物,用方率占45%,用藥率占6.87%。將本次數據挖掘中單味中藥使用頻次≥8次的中藥作為高頻中藥,分別是茯苓、半夏、桂枝、生姜等,共計20味,累計使用頻次300次,占總中藥使用頻次的45.8%,具體結果見表1。

表1 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥頻次表

2.1 高頻中藥藥性和藥味分析結果

對納入標準的高頻中藥藥性和藥味進行統計分析,一味中藥有多種性味,則全部統計在內。高頻中藥藥性分為溫(6味,30%),微溫(3味,15%),平(5味,25%),寒(4味,20%),微寒(2味,10%)5種。高頻中藥藥味分為苦味(11次,35.48%),甘味(10次,32.26%),辛味(8次,25.81%),酸味(1次,3.23%),淡味(1次,3.23%)。見圖1。

圖1 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥藥性、藥味雷達圖

2.2 高頻中藥歸經和功效分析結果

依據分類標準,一味中藥如果有多個歸經,則全部統計在內。高頻中藥歸經分為心經(12次,18.46%),肺經(10次,15.38%),脾經(10次,15.38%),肝經(9次,13.85%),大腸經(7次,10.77%),胃經(7次,10.77%),腎經(6次,9.23%),膀胱經(2次,3.08%),小腸經(1次,1.54%),膽經(1次,1.54%)。高頻中藥功效分為補虛藥(74次,24.67%),化痰止咳平喘藥(48次,16%),利水滲濕藥(45次,15%),解表藥(44次,14.67%),清熱藥(26次,8.67%),理氣藥(24次,8%),活血化瘀藥(23次,7.67%),化濕藥(8次,2.67%),安神藥(8次,2.67%)。見圖2。

圖2 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥歸經、功效雷達圖

2.3 高頻中藥的關聯規則分析結果

設置最小規則置信度≥60%,最低條件支持度≥7%,最大前項數是5,獲得常用藥物組合11項。所得藥物組合由3味藥組成的有3項,由2味藥組成的有8項,具體結果見表2。其中,中藥使用頻次與點的大小呈正相關,用線條粗細深淺表示藥物關聯強弱程度。見圖3。

圖3 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥配伍網絡圖

表2 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥關聯規則分析結果

2.4 高頻中藥聚類分析結果

以橫向聚類圖展示,當截距為21,聚為5類時,各類別中藥基本達到穩定。聚類分析結果見表3,聚類譜系圖見圖4。

圖4 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥聚類分析圖

表3 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥聚類分析結果

2.5 因子分析結果

選用Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)取樣適切性量度和巴特利特(Bartlett)球形度檢驗辨別樣本是否適合進行因子分析,對使用頻次≥8次的20味高頻中藥降維分析,得出KMO值為0.550,Bartlett球形度檢驗近似卡方值為389.384,自由度為190,顯著性P<0.001,提示各變量間具有較強的相關性,可以進行因子分析。

采用主成分分析,最大方差旋轉法提取初始特征值大于1的公因子,使用觀測相關系數與偏相關系數,排除小系數,指標大于0.3,提取出符合初始特征值的8個公因子,具體結果見表4。繪制因子載荷圖和碎石圖。見圖5。

圖5 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥因子分析的載荷圖與碎石圖

表4 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥公因子信息

2.6 網絡藥理學結果

2.6.1 核心藥物組合的活性成分及預測靶點 半夏-生姜-茯苓是關聯性最強的一項藥物組合,將其作為核心中藥分析葉天士治療胸痹心痛的潛在機制。使用BATMAN-TCM數據庫篩選獲得半夏的活性成分有22個,生姜的活性成分有67個,茯苓的活性成分有10個,去除1個重復項“Choline”后共得活性成分98個。篩選獲得半夏預測靶點256個,生姜預測靶點394個,茯苓預測靶點72個,合并去重后獲得核心藥物組合半夏-生姜-茯苓靶點共520個。

2.6.2 疾病的相關靶點 設定GeneCards數據庫的Relevance score>10,以檢索式在上述4個選定的數據庫里分別檢索,合并4個數據庫結果并去重,獲得胸痹心痛病相關靶點共4 322個。

2.6.3 核心藥物組合與疾病交集靶點 將核心藥物組合半夏-生姜-茯苓的520個靶點與胸痹心痛病的4 322個靶點取交集,見圖6。獲得交集靶點205個,此為核心藥物組合半夏-生姜-茯苓治療胸痹心痛病的關鍵靶點。

圖6 核心藥物組合-疾病的共同靶點韋恩圖

2.6.4 疾病相關靶點的相互作用和核心靶點篩選結果 將2.6.3得到的205個靶點導入STRING網站,PPI分析包括204個節點,1 668條邊,平均節點度是16.4,平均局部聚類系數是0.464,PPI富集P<0.001,提示靶點間相互作用較強。獲取共同作用靶點的PPI網絡圖,見圖7。將PPI網絡作用關系結果導入Cytoscape3.9.1,由圖8可知,Degree值排名前3的核心靶點分別是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、FOS原癌基因(fos proto-oncogene,FOS)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)3,其中Degree值最高的是TNF。

圖7 核心藥物組合治療胸痹心痛病共同作用靶點的蛋白互作網絡圖

圖8 核心藥物組合治療胸痹心痛病的靶蛋白互作關系圖

2.6.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析結果 GO功能富集結果得出BP共1 268個條目,主要涉及調節血液循環(regulation of blood circulation)、心臟收縮的調節(regulation of heart contraction)、心率調節(regulation of heart rate)、心肌細胞收縮(cardiac muscle cell contraction)等; CC共126個條目,主要涉及跨膜轉運復合物(transmembrane transporter complex)、質膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)、鈣通道復合物(calcium channel complex)、肌纖維膜(sarcolemma)等; MF共207個條目,主要涉及單原子離子門控通道活性(monoatomic ion gated channel activity)、單原子離子跨膜轉運蛋白活性(monoatomic ion transmembrane transporter activity)、被動跨膜轉運蛋白活性(passive transmembrane transporter activity)等。BP、CC、MF按排序結果各選取前10條,見圖9。

圖9 核心藥物組合靶點的GO功能富集分析圖

KEGG通路富集結果得出171個條目,核心藥物組合靶標基因顯著富集在鈣離子(calcium,Ca2+)和環狀鳥苷單磷酸酯-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G,cGMP-PKG)等信號通路。按排序條件選取前20條,見圖10。

圖10 核心藥物組合靶點的KEGG信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

《葉天士醫學全書》集葉天士所編著的醫學著作于一體,縱觀其記載的胸痹心痛篇諸案,可見葉天士勤求古訓,博采眾長,學習張仲景寶貴治療經驗并加以繼承和發揚,守“陽微陰弦”之病機,以溫通之法消散陰痹,同時重視臟腑間功能協調。本文基于上述數據挖掘結果,對用藥規律進一步討論,分析新處方組方特色,同時運用網絡藥理學探討核心藥物組合的潛在通路和靶點,具體結果如下。

用藥頻次統計顯示,使用頻次最高的是茯苓。茯苓有利尿、降血脂、調節胃腸道功能的作用,常被用于治療水腫、痰飲、心悸、心衰和脾虛泄瀉等疾病[9]。細胞凋亡、炎性因子大量釋放是心肌缺血的重要發生機制[10],而茯苓中的茯苓酸成分有抑制細胞凋亡的功能,桂枝茯苓丸組合方的活性成分能有效抑制炎性因子的釋放[11-13],并且此方中的主要成分桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁皆是本次數據挖掘的高頻中藥。高頻中藥的藥性多為溫、平,甚少使用大寒、大熱之品,藥味多甘、苦、辛之品,甘能補、能和緩,苦能燥濕、能泄降氣逆,辛能行氣血、能發散。入心、肺、脾經藥物最多,功效多為補虛、化痰止咳平喘、利水滲濕等。葉天士認為“若夫胸痹,則但因胸中陽虛不運……惟流運上焦清陽為主”。這一觀點繼承了張仲景“陽微陰弦”的思想,因此在用藥上多使用了桂枝、薤白、生姜、人參這類溫陽補氣的藥物來改善心氣不足或心陽虧虛時出現的胸痛癥狀。這既反映了葉天士治療胸痹心痛病用藥多溫補、避免攻伐之性的特色,也與胸痹心痛病的主證和本虛標實的病機相符合。《靈樞·本藏》記載“肺大則多飲,善病胸痹,喉痹,逆氣”,證實胸痹與肺中水飲有關,水濕停聚,上犯心肺,氣行失暢,發為胸痹[14],故用半夏、瓜蔞、茯苓、厚樸化痰散結,行氣祛濕。血脈痹阻,不通則痛,葉天士喜用“活血化瘀法”,桃仁、延胡索、當歸等藥物是養血活血、行氣止痛之品,現代藥理學證明此類藥物能改善心肌缺氧、擴張血管、抗血小板凝集、降低心絞痛的發作頻率[15]。葉天士治療胸痹心痛病不僅考慮陽虛證候,亦兼顧陰虛之象。若腎陰虧虛,不能濡養五臟之陰,水不涵木,心肝火旺,損傷心陰,心脈失于濡養,亦可導致胸痹,因此葉天士常用枸杞子、地黃、白芍、甘草、人參等藥物益氣養陰,滋補肝腎。

關聯規則分析發現3味藥組成的藥物組合半夏-生姜-茯苓的關聯性最強,2味藥組成的藥物組合半夏-生姜關聯性最強。半夏、生姜和茯苓這3味藥在《傷寒雜病論》中被視為心系病證的通用藥[16],半夏和生姜組成了“小半夏湯”。孫思邈《千金要方》卷十小半夏湯條方后附記記載“有人常積氣而死,其心上暖,以此半夏湯少許汁入口中遂活”,此積氣即為孫思邈對胸痹的一種稱呼,“積氣而死”指的是胸痹發作瀕臨死亡,煎服小半夏湯后則可得救。此外生姜可以制約半夏毒性,二者配伍,以半夏為主藥,生姜為輔藥,若加入茯苓,則為小半夏加茯苓湯的組方,有加強燥濕化痰、降逆止嘔的功效,故此方常被使用在心臟移植術后減輕心臟損傷[17]。

聚類分析可以得出5類藥物組合,根據功效能總結為3首新處方。C1(半夏,生姜,苦杏仁,厚樸,薤白,瓜蔞,茯苓)是瓜蔞薤白半夏湯合小半夏加茯苓湯的化裁方,有通陽散結、祛痰寬胸的功效。C2(白芍,甘草,桂枝)+C4(川楝子,延胡索,桃仁),方中桂枝和甘草溫心陽,白芍、川楝子、延胡索和桃仁養血活血,化瘀止痛。C3(人參,黃連)+C5(當歸,柏子仁,枸杞子,牡丹皮,地黃)是柏子養心湯合清胃散的化裁方,有補氣養血、養陰安神、清臟腑熱的功效。

因子分析與聚類分析結果大致相同,共得到8個公因子,根據功效總結為3首新處方,F1(生姜,半夏,苦杏仁,厚樸,薤白)+F6(人參,瓜蔞)+F7(茯苓)為瓜蔞薤白半夏湯合厚樸生姜半夏甘草人參湯化裁,主通陽散結,健脾消滿,祛痰寬胸;F2(延胡索,川楝子,桃仁)+F3(甘草,白芍,桂枝)主養血活血,疏肝理氣,溫通止痛;F4(枸杞子,當歸,柏子仁)+F5(地黃,牡丹皮)+F8(黃連)能益氣養陰,養血安神。

網絡藥理學研究結果顯示,與本病密切相關的核心靶點是TNF、FOS、NOS3,最核心的靶點可能是TNF。研究發現,TNF在心臟廣泛表達[18],TNF為炎性因子,參與炎癥反應,它可以調節外周阻力和心臟收縮力,當冠心病癥狀改善時,TNF水平降低[19-20]。NOS3又稱一氧化氮合酶3,已被證實多與冠心病發病有關[21]。核心藥物組合半夏-生姜-茯苓治療胸痹心痛病的相關靶點顯著富集的信號通路是鈣離子信號通路和cGMP-PKG信號通路。Ca2+是心肌細胞收縮過程中關鍵的離子電流,與體內多種鈣離子信號通路緊密結合[22]。研究表明,鈣通道阻滯劑能明顯緩解冠狀動脈痙攣,減輕心絞痛,改善心肌梗死[23]。cGMP由鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase,GC)產生,通過激活下游PKG靶向各種分子來調節心肌細胞中的細胞功能,能有效治療伴有心力衰竭的冠心病[24-26],同時活化Ca2+激動冠狀動脈血管平滑肌上K+通道從而調控血管舒張力[27]。由此可見,核心藥物組合半夏-生姜-茯苓可能通過TNF、FOS、NOS3等靶點對鈣離子信號通路,cGMP-PKG信號通路進行調控從而發揮改善胸痹心痛的作用,網絡藥理學的結果與現代研究的結論一致。

本研究通過數據挖掘《葉天士醫學全書》中葉天士治療胸痹心痛病常用處方,結合網絡藥理學,分析葉天士治療胸痹心痛疾病的用藥規律,得出葉天士治療胸痹心痛病多從溫陽化痰、活血化瘀、益氣養陰3個方面選方用藥,通過關聯規則分析得出核心藥物組合,揭示其潛在靶點和通路,為現代臨床使用中藥治療胸痹心痛病提供了新的組方思路。本研究相關醫案收集較少,樣本量稍顯不足,且未記載用藥劑量,今后將進一步深入研究。