益氣解毒方對12 Gy60Coγ射線誘導的支持細胞鐵死亡的防護作用及機制研究?

莊鑫麗,姜薈茜,徐旻灝,葉一帆,徐文慧,王 安,王 磊,王舒冉,趙章弟,張文彥,張淑靜,胡素敏

(北京中醫藥大學,北京 100029)

據世界衛生組織統計,全球有近15%的育齡夫婦受不孕不育問題的困擾,其中男性因素占50%[1]。由于睪丸組織對放射線非常敏感,長期接觸放射線的男性出現生殖障礙的概率更高[2]。放射線會造成曲細精管的各級生精細胞和支持細胞損傷,影響精子的生成,造成男性不育[3]。支持細胞是曲細精管內唯一與生精細胞直接接觸的體細胞,為精子發生提供物理支撐、穩定的微環境以及營養支持[4],保證精子發生的正常有序進行,一旦受損必然影響精子發生。近年來有研究顯示,電離輻射可引發一種新型、依賴活性氧和鐵的調節性細胞死亡形式——鐵死亡[5-6]。本課題組前期研究表明,放射線會引起小鼠睪丸組織氧化損傷,誘導鐵死亡發生,導致生精功能障礙[7]。課題組前期研究表明益氣解毒方對上述損傷有很好的防護作用。那么,放射線是否誘導睪丸支持細胞發生鐵死亡?益氣解毒方是否能干預支持細胞的鐵死亡?為明確以上兩個問題,本文以小鼠睪丸支持細胞為切入點展開研究,以期為進一步探討該方防治睪丸輻射損傷的潛在分子機制奠定基礎。本實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審核通過,編號：BUCM-4-20211120301-4085 。

1 材料

1.1 動物與細胞

5～6周齡SPF級SD大鼠40只,雄性,體質量(170±10)g,由斯貝福(北京)生物公司提供,動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠飼養于北京中醫藥大學動物房,溫度(23±2)℃,濕度(50±10%),動物自由攝食飲水。

TM4細胞(正常小鼠支持細胞)購自國家實驗細胞資源共享平臺,細胞編號為：1101MOU-PUMC000298。

1.2 藥物與試劑

益氣解毒方由黃芪30 g、馬齒莧15 g、枸杞子10 g 、當歸6 g、茯苓12 g、白芍10 g、西洋參6 g、淫羊藿10 g等組成,飲片均購自北京同仁堂有限公司,并由北京中醫藥大學中醫學院中藥教研室老師鑒定,符合《中華人民共和國藥典》規定[8]。

胎牛血清(依科賽生物科技有限公司,貨號：FND500);DMEM/F12培養基(美國Invitrogen公司,貨號：C11330500BT);胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司,貨號：T1300);細胞計數試劑(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒(北京翱擎生物科技有限公司,貨號：AQ308-500t);Erastin(美國APExBIO公司,貨號：B1524);Liproxstatin-1 (美國Selleck生物科技有限公司,貨號：S7699);高遷移率族蛋白B1 ( high mobility group protein box-1, HMGB1) ELISA試劑盒(武漢云克隆生物科技有限公司,貨號：SEA399Mu);活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒,JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司,貨號：S0033S,C2006);鐵離子比色法檢測試劑盒,蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司,貨號：E1042,P1511);總RNA小量抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,貨號：R4111-02);逆轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號：K1622);實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒(蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司,貨號：E096-01A)。

1.3 儀器

循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿公司,型號：SHB-Ⅲ),CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號：Heracell Vios 160i),臺式高速冷凍離心機( 德國 Eppendorf 公司,型號：5424R),BioTek Epoch全波長酶標儀(美國BioTeK公司,型號：Epoch2C),熒光酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號：Varioskan LUX ),正倒置一體熒光顯微鏡(美國 Echo 公司,型號：Echo Revolve),超微量紫外可見分光光度計(杭州遂真生物技術有限公司,型號：F-2100 ),T100梯度PCR儀(美國 Bio-Rad 公司,型號：T100 Thermal Cycler),RT-qPCR擴增儀(美國 Bio-Rad 公司,型號：CFX96 ) 。

2 方法

2.1 含藥血清制備

益氣解毒方水煎液制備方法與本課題組前期制備方法一致[9],參考《藥理實驗方法學》[10],將人用藥劑量換算成大鼠等效劑量。所有藥材洗凈后加10倍水量浸泡1 h,武火煮沸后文火繼續煮1 h,濾出第一次藥液。藥渣繼續加8倍水量煎煮,步驟同第一次煎藥液,將兩次藥液混勻,繼續加熱濃縮至原藥材為1～2 g/mL。藥液靜置冷卻后緩慢加入無水乙醇至乙醇濃度為60%,4 ℃冰箱靜置24 h,減壓抽濾藥液,回收乙醇,最終得到生藥濃度為1.044 g/mL的藥液。因前期研究發現益氣解毒方中、低劑量組對生殖系統輻射損傷的防護效果優于高劑量組[11-12],所以本實驗選用了效果較好的兩個劑量進行研究。本次實驗高劑量益氣解毒方給藥量為人體臨床等效劑量,生藥濃度為1.044 g/mL,低劑量益氣解毒方給藥量為人體臨床等效劑量0.5倍, 生藥濃度為0.522 g/mL。

SD大鼠適應性飼養10 d,隨機分為空白組和益氣解毒方高、低劑量組,空白組20只,給藥組各10只。空白組灌胃去離子水,益氣解毒方高、低劑量組分別灌胃高、低劑量中藥復方懸液,給藥劑量為1 mL/100 g,連續灌胃5 d。末次給藥后30 min,麻醉大鼠,腹主動脈取血,將采血管于室溫靜置4 h后,離心,取血清,同組混合分裝至離心管中,于56 ℃水浴鍋中30 min滅活,經0.22 μm微孔過濾膜除菌,將含藥血清于-20 ℃凍存備用。

2.2 細胞培養、分組及造模

本研究選用鐵死亡激動劑(erastin)作為陽性對照組,鐵死亡抑制劑(liproxstatin-1, Lip-1)作為陽性藥對照組。激動劑及抑制劑制備方法：將 Erastin和Lip-1分別溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),再用無血清培養基稀釋成所需濃度。

支持細胞培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培養基中,置于含有5%CO2的37 ℃培養箱中,后續取對數生長期的支持細胞用于實驗。細胞分組及處理如下：空白(negative Control, NC)組：支持細胞+空白組大鼠血清;模型(ionizing Radiation, IR)組：支持細胞+IR+空白組大鼠血清;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組：支持細胞+IR+益氣解毒方高劑量含藥血清;益氣解毒方低劑量(YQJD-L)組：支持細胞+IR+益氣解毒方低劑量含藥血清;鐵死亡激動劑(Erastin)組：支持細胞+空白組大鼠血清+Erastin,照射前4 h加入 Erastin,使 Erastin的終濃度為 5 μmol/L;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組：支持細胞+IR+空白組大鼠血清+Lip-1,照射前4 h加入 Lip-1,使 Lip-1的終濃度為 0.2 μmol/L。

造模方法與本課題組前期研究一致[12],除空白組和鐵死亡激動劑組的支持細胞外,其余各組細胞都使用12 Gy60Coγ射線進行一次性照射,照射劑量率為1 Gy/min。

2.3 細胞活性檢測

消化細胞后,將密度調整至8×104/mL,接種于96孔板中,每孔100 μL,6 個復孔/組。接種后24 h按照2.2中的方法復制支持細胞輻射損傷模型,在照射24 h后,加入CCK8溶液,10 μL/孔,繼續孵育2 h。孵育結束后,使用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,并按照CCK8說明書計算細胞存活率。

2.4 熒光酶標儀檢測支持細胞ROS水平

將DCFH-DA探針用無血清培養基按1：1 000的比例稀釋至10 μmol/L。細胞按照8×104/mL的密度接種于12孔板中,每孔1 mL,6個復孔/組。分組處理后,消化細胞,調整細胞密度為2×105/mL,收集于1.5 mL離心管中,用無血清培養基洗滌2次,重懸于稀釋好的DCFH-DA懸液,于37 ℃培養箱中避光孵育20 min,每隔5 min顛倒混勻一次,讓細胞充分接觸探針。孵育結束后,細胞用無血清培養基洗滌3次,最后重懸于500 μL的無血清培養基中,取100 μL重懸液移入黑色的96孔板,熒光酶標儀設定激發波長為488 nm,發射波長為525 nm,測定熒光強度,熒光強度直接反映了細胞內的ROS水平。

2.5 鐵離子比色法試劑盒檢測支持細胞二價鐵離子(Fe2+)水平

將支持細胞按照8×104/mL的密度接種于6孔板內,每孔2 mL,每組設6個復孔,經分組處理后,去除培養基,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,吸棄PBS。每孔加入200 μL 裂解液裂解細胞,置于搖床裂解2 h后,取25 μL裂解液用BCA法檢測蛋白濃度,根據BCA標準曲線計算出樣本濃度,再加入不同體積的裂解液調整至樣本濃度一致,每個樣本取100 μL裂解液于1.5 mL離心管中,加入100 μL混合液A(按說明書配制),混勻,于60 ℃水孵育1 h,再加入30 μL鐵離子檢測劑,混勻,室溫孵育30 min,取上述混合液體200 μL于96孔板,在550 nm波長處測定吸光度,繪制標準曲線并計算鐵離子濃度。

2.6 ELISA檢測細胞上清液 HMGB1水平

將細胞按照 8×104/mL 的密度接種于24孔板中,每組設6個復孔。細胞經分組處理后,于照射后24 h吸取細胞培養液。嚴格按照HMGB1檢測試劑盒說明書進行操作,應用酶標儀在450 nm波長處讀板,檢測細胞上清液中HMGB1水平。

2.7 JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位

將細胞按照 8×104/mL 的密度接種于24孔板中,每孔0.5 mL,3個復孔/組。細胞經分組處理后,吸除培養液,用無菌PBS清洗。每孔加入0.25 mL 無血清培養基和0.25 mL的JC-1染色工作液,混勻,于培養箱中避光孵育20 min。孵育結束后,吸除上清液,用配制好的JC-1緩沖液洗滌2次,再加入0.5 mL的無血清培養基,在熒光顯微鏡下觀察、拍照,并用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.8 RT-qPCR檢測鐵死亡相關mRNA的表達水平

細胞以8×104/mL接種于6孔板中,每孔2 mL。分組處理后采用總RNA小量抽提試劑盒說明書操作提取總RNA。檢測RNA濃度及純度,結果中A260/280的取值在1.9～2.1之間,說明提取的RNA純度高,可以用于后續實驗。每個RNA樣本取3 μg用于逆轉錄,按逆轉錄試劑盒說明書配制20 μL的逆轉錄體系,逆轉錄條件：42 ℃孵育60 min,70 ℃孵育5 min,終止反應。進行擴增,擴增體系：SYBR 10 μL,上下游引物各 0.4 μL,cDNA 2 μL,無酶水7.2 μL;擴增條件：95 ℃變性5 min,95 ℃循環10 s,55 ℃循環30 s,循環40次。本實驗選取GAPDH作為內參,2-△△Ct表示目的基因相對定量,引物序列見表1。

表1 鐵死亡相關基因引物序列

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 益氣解毒方對12 Gy60Coγ射線輻射后支持細胞活力的影響

與NC組比較,Erastin組和IR組細胞活力顯著下降(P<0.01);與IR組比較,Lip-1組、YQJD-H組、YQJD-L組的細胞活力均顯著提高(P<0.01)。結果見圖1。

注：與NC組比較**P<0.01;與IR組比較##P<0.01;空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組;益氣解毒方低劑量(YQJD-L)組

3.2 益氣解毒方對12 Gy 60Coγ射線輻射后支持細胞ROS、Fe2+、HMGB1水平的影響

與 NC組比較,IR組ROS、Fe2+、HMGB1水平均顯著升高 (P<0.01),趨勢與Erastin組一致。與IR組比較,Lip-1組、YQJD-H組、YQJD-L組的ROS、Fe2+、HMGB1水平均降低(P<0.01)。與YQJD-H組比較,YQJD-L組ROS、Fe2+、HMGB1水平升高(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組支持細胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平

由于益氣解毒方高、低劑量組含藥血清均對輻射后的支持細胞活力降低及ROS、Fe2+、HMGB1水平升高具有明顯的防護作用,且高劑量益氣解毒方的防護作用比低劑量益氣解毒方更顯著(P<0.05),因此本研究在后續實驗中僅選用益氣解毒方高劑量組作為益氣解毒方組的代表劑量進一步研究。

3.3 益氣解毒方對12 Gy 60Coγ射線輻射后支持細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位的異常改變不僅是線粒體損傷的重要標志,也是鐵死亡發生的早期預警[13]。JC-1染色表明,與NC組比較,Erastin組和IR組細胞線粒體JC-1聚合物降低,紅色熒光減弱(P<0.01),線粒體膜電位降低。與IR組比較,Lip-1組和YQJD-H組支持細胞的線粒體膜電位均顯著提高(P<0.01)。結果見圖2、表3。

注：空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組

表3 各組支持細胞的線粒體膜電位相對熒光強度

3.4 益氣解毒方對 12 Gy60Coγ射線輻射后支持細胞鐵死亡相關mRNA表達水平的影響

與NC組比較,IR組和Erastin組的GPX4 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);IR組的ACSL4和 LPCAT3 mRNA 水平顯著升高(P<0.05);而Erastin組的ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平呈升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。與 IR 組比較,Lip-1組GPX4、ACSL4和LPCAT3 mRNA表達水平均呈升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。與 IR 組比較,YQJD-H組的GPX4 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平顯著降低(P<0.05)。結果見圖3。

注：與NC組比較*P<0.05;與IR組比較#P<0.05;空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組

4 討論

近半個世紀以來,男性精液質量以及男性生育率的下降趨勢十分明顯[14-15],而電離輻射是導致男性不育的重要原因之一。放射線可引起睪丸生精功能損傷,使精子發生出現異常。精子發生的過程離不開支持細胞,支持細胞為各級生精細胞提供了重要的骨架支撐以及營養物質,并且能夠通過緊密連接形成血睪屏障,為精子發育提供必要的微環境[4]。研究表明,電離輻射作用于生殖系統,不僅會造成生精細胞的損傷,也會導致支持細胞變性、壞死、破壞其緊密連接結構,進而破壞生精微環境,不利于精子的生成[16-17]。課題組前期研究表明,電離輻射可嚴重損傷由支持細胞緊密連接構成的血睪屏障,使生精功能受損[18],且生精功能的這一損傷與鐵死亡密切相關[7]。

鐵死亡是一種在形態、生化方面有特征性變化的細胞死亡方式,主要生化特征為Fe2+水平升高、ROS聚積,形態特征為線粒體萎縮、外膜破裂、嵴減少或消失[19]。線粒體是細胞內產生ROS的主要場所,當細胞內Fe2+含量升高時,會通過芬頓反應產生大量ROS,導致線粒體損傷、膜電位下降[20],并使細胞處于氧化應激狀態,誘發脂質過氧化反應,對細胞結構產生嚴重破壞,致使細胞大量死亡。HMGB1是細胞內高度保守的核蛋白,能夠由細胞發生鐵死亡后所釋放,被認為是鐵死亡中的關鍵作用分子[21-22]。研究表明,ROS累積能夠促進HMGB1從細胞核易位到細胞質,從而促進HMGB1的分泌,進一步促進細胞鐵死亡[23]。本研究發現,12 Gy60Coγ射線照射后,支持細胞的細胞活力及線粒體膜電位降低,而Fe2+、ROS及HMGB1水平均顯著升高,上述指標的變化趨勢均與鐵死亡誘導劑Erastin的作用結果一致,且能被鐵死亡抑制劑Lip-1所抑制,提示電離輻射導致了支持細胞鐵死亡的發生。

調控鐵死亡的通路有很多,其中Xc-/GPX4通路是主要的發生途徑之一。GPX4是鐵死亡通路的中心調控因子,能夠抑制細胞的過氧化,保護其免受鐵死亡的影響,它的缺失會造成ROS的累積和脂質過氧化物的增多[24]。ACSL4和LPCAT3是脂質代謝過程中的重要調節者,可以通過催化多不飽和脂肪酸轉化為脂質過氧化物,進而誘發鐵死亡[25-26],而GPX4可以抑制ACSL4及LPCAT3的活性,降低多不飽和脂肪酸和脂質過氧化物的產生[27-28]。本研究發現,12 Gy60Coγ射線照射后,支持細胞的GPX4 mRNA表達水平降低,ACSL4、LPCAT3 mRNA表達水平升高,表明電離輻射能夠通過GPX4/ACSL4/LPCAT3通路,使細胞ROS累積、脂質代謝異常,進而誘發支持細胞鐵死亡。

鐵死亡屬于調節性細胞死亡(regulated cell death,RCD)的一種[29],可以通過藥物或基因干預來進行調節。既往研究表明,鐵死亡是疾病發展進程中的早期事件,會進一步觸發炎癥反應和繼發性壞死性細胞死亡[30-31],因此,早期用藥物對鐵死亡進行調節,對病程的截斷具有重要意義。中醫理論認為,電離輻射具火毒之性,課題組通過前期的病因學研究,將其命名為“電離毒”,認為其所致損傷具有暴戾性、廣泛性、頑固性等特點[32]。根據“電離毒”的致病特點,課題組以中醫治未病理論為指導,做到未病先防,既病防變[33],這與鐵死亡的早期干預不謀而合。源自臨床的益氣解毒方能夠益氣養陰、補血生精、涼血解毒,在體內和體外實驗中均被證實對輻射造成的生殖損傷具有良好的防治效果[7,12,18]。本研究發現,益氣解毒方能夠恢復照射后支持細胞的活力、線粒體膜電位,降低照射后支持細胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平,并且能夠緩解GPX4 mRNA的下降趨勢,與鐵死亡抑制劑Lip-1作用一致。此外,益氣解毒方還降低了ACSL4、LPCAT3 mRNA表達水平,說明該方可以通過GPX4/ACSL4/LPCAT3信號通路,調控電離輻射后細胞的鐵代謝、脂質代謝平衡,從而維持細胞內鐵水平含量平衡,減少細胞中脂質過氧化物的積累,減輕支持細胞鐵死亡,從而減輕輻射損傷。

綜上,本研究證實了鐵死亡參與小鼠睪丸支持細胞輻射損傷,而益氣解毒方可通過調控GPX4/ACSL4/LPCAT3信號通路,減輕小鼠睪丸支持細胞鐵死亡,起到輻射防護作用。在下一步的研究中,將進一步探討電離輻射誘導的支持細胞鐵死亡影響了該細胞的哪些結構或功能,益氣解毒方對上述結構或功能損傷又發揮了怎樣的防護作用,從而為進一步揭示睪丸輻射損傷的分子機制及益氣解毒方的防護機理奠定基礎。