魯北地區慢性失眠人群腸道菌群特征分析

李東陽， 白 玉， 郭 澳， 馬文彬

腸道菌群（intestinal flora）是在人類胃腸道中與宿主存在共生關系的細菌和其他微生物［1］，其參與機體的生理和病理調節，在人體免疫系統和代謝中發揮著重要作用。腸道和中樞神經系統可以通過腸-腦軸起到雙向調節作用［2］。慢性失眠的主要臨床表現為入睡困難、睡眠時間減少、睡眠中頻繁覺醒等，并且隨年齡的增加逐漸加重［3］。失眠的發病機制尚未完全闡明，近年來有研究發現腸道菌群在睡眠調節中扮演著重要角色［4］，腸道菌群可以通過腸-腦軸的免疫系統、內分泌系統和迷走神經通路影響中樞神經的各項功能［5］，進而對機體的睡眠過程進行調節。迄今為止，慢性失眠與腸道菌群之間關系仍需要進一步探索。本研究結合16S rDNA擴增子測序和生物信息學分析，首次檢測魯北地區健康參與者和失眠患者之間腸道微生物群的相關性和差異性，擬在探討失眠患者的腸道分類群組成的差異和潛在關系，為腸道菌群在失眠中的臨床應用提供新依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象 2022年1月—7月就診于濱州醫學院附屬醫院神經內科門診的慢性失眠患者30 例，患者來自濱州、東營和德州地區，年齡在18～65 歲之間。健康人群33 例為對照，志愿者從濱州醫學院附屬醫院神經內科門診及公眾招募。本實驗經過濱州醫學院附屬醫院倫理委員會批準（批準號：LW-13），在被告知權利和義務后，所有參與者都完全理解了實驗的益處和風險，并簽署了知情同意書。所有參與者均符合嚴格的納入標準和排除標準，并由2 名神經內科醫生進行問卷及專科評估。研究參與者的糞便樣本均在門診就診當天用無菌器械采集，然后保存在-80℃的冰箱中準備16S rDNA 測序。研究參與者還需要完成一份描述人口統計學和生活方式特征的問卷，缺少或無法確認的人口統計學數據（年齡、種族或性別）、BMI 被排除在研究之外。最后，將63 名確認2 周內未使用抗生素的合格志愿者分為兩組（慢性失眠組和正常對照組），兩組間BMI差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 16S rDNA 測序 北京諾和致源科技股份有限公司提供糞便樣本擴增子測序技術服務。利用ZR糞便DNA試劑盒從患者糞便中提取細菌DNA，用Illumina HiSeq 2500 測序儀的優化引物組對覆蓋16S rDNA基因V3～V4區的多重擴增子文庫進行PCR擴增。

1.3 生物信息學分析 對測序后的序列進行預處理，產生雙端合并序列，并使用軟件Vsearch（v2.18.0）去除重復序列，使用軟件Usearch（v11.0.667）降噪算法unoise3 產生ASV，去除嵌合體，使用軟件Vsearch （v2.18.0）進行物種注釋，使用的數據庫為 RDPv18（細菌、古菌16s）或UNITE 25.07.2023（真菌ITS），最后使用軟件R（v3.5.2）語言進行抽平、統計和作圖，包括繪制主坐標分析（Principal Coordinats Analysis， PCoA）和相關性熱圖，通過計算UniFrac 距離來估計β 多樣性，通過LEfSe分析對所有分類水平進行差異分析，識別組內組間物種豐度差異，來檢測兩組間的差異豐富分類群，統計抽平后樣本擴增子序列變異（ASV），獲得每個樣本的微生物群落的具體組成，對兩組在門、綱、目、科、屬水平的物種進行可視化處理，并使用R 包“randomForest”進行隨機森林分析。

2 結 果

2.1 失眠患者較正常人群存在腸道菌群的結構和功能的顯著變化 分別計算了慢性失眠（IN）組和正常（HC）組ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指數，反映了兩組間的α 多樣性，且存在腸道微生物多樣性的改變（見圖1）。此外，基于Bray-Curtis 距離的β 多樣性分析表明，失眠（IN）組和正常（HC）組在空間距離的第一維度上存在顯著的結構差異（見圖2）。通過線性判別分析效應大小（LDA EFfect Size，LEfSe）分析顯示兩組的相對豐度存在顯著差異，尤其是梭狀芽孢桿菌、厚壁菌門等菌屬（見圖3）。基于picrust2 功能基因預測結果表明，慢性失眠組和正常組的腸道菌群功能相關基因無顯著區別。對測序后物種從門、綱、目、科、屬水平上進行了相對豐度分析，我們發現在門水平，相對豐度最高的菌群包括梭桿菌門、擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、疣微菌門等（見圖4）。

圖1 慢性失眠（IN）組和正常對照（HC）組的α多樣性分析

圖2 基于Bray-Curtis距離的β多樣性分析

圖3 LDA EFfect Size分析

圖4 門水平上物種相對豐度分析

2.2 通過隨機森林分析識別與失眠癥相關的腸道微生物群 傳統的方法，如LEfSe 分析，通過比較各組之間腸道菌群相對豐度的差異，鑒定的生物標志物建立疾病診斷的預測模型比較困難。為了改進生物標志物的識別，我們采用隨機森林分析，在考慮最低誤差率加標準偏差的情況下，鑒定最佳的物種生物標志物。其中，ASV_17（毛螺菌科）是慢性失眠組和正常分組貢獻最高的ASV（見圖5）。

圖5 隨機森林分析

3 討 論

健康成年人腸道中的菌群種類和數量十分龐大，大約包括1 000 多種菌群，細菌的總數則超過了100 萬億，腸道菌群主要包括厚壁菌、擬桿菌、放線菌、疣微菌和變形菌等五個菌門，其中主要為厭氧菌［6］。大量證據表明，睡眠在保護人類健康、恢復身體功能、增強免疫力、保護大腦健康等方面均發揮著十分重要的作用［7］，并可以通過腸-腦軸與腸道菌群建立聯系。

到目前為止，有關睡眠不足對人體腸道微生物群組成的影響的研究并不多見，曾有研究對大鼠行7 d的睡眠限制后，并未檢測到主要微生物種群的改變［8］。Poroyko等［9］在研究中發現，對小鼠行4周的睡眠剝奪后可明顯觀察到體內腸道微生物群的變化。有證據表明，隨著睡眠剝奪時間的不斷延長，人類腸道微生物群的受到的影響程度會逐漸增強。針對連續數個晚上保持2 h 以內睡眠的實驗會降低腸道微生物群的豐富度，并且α 多樣性的相對豐度增大［10］，而在另一項研究中，將睡眠時間延長到每晚4 h后則對β多樣性沒有產生影響［11］。

迄今為止，對于睡眠障礙可以具體改變腸道微生物群的哪些細菌種類的結論尚未完全一致［9］。在睡眠中斷的小鼠中，厚壁菌門與擬桿菌門的比例增加［12］，梭狀芽孢桿菌科和毛螺菌科的相對豐度也發生相應改變［13］，并且毛螺菌科種群數量的增加或減少還可能和腸道的不同部位有很大關系［14］。另一方面，一項對37 名老年人進行的橫斷面研究發現，更好的睡眠質量則與疣狀梭菌門比例相關［15］。本次實驗通過LEfSe 分析（判斷標準LDA 值＞3.0，P＜0.05）觀察到魯北地區慢性失眠（IN）組中梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等一些菌屬的相對豐度與正常組存在統計學差異（P＜0.05），同時通過隨機森林分析發現，毛螺菌科種群數量在魯北地區慢性失眠人群中顯著增加，這些發現更進一步豐富了失眠對腸道菌群組成影響的研究。有研究表明睡眠可以影響到腸道菌群的代謝功能，睡眠破碎可能導致產生丁酸的細菌的豐度減少，并進一步影響丁酸代謝［16］。Christian等［13］在正常體重個體中進行了一項研究，評估睡眠不足對人類腸道微生物群的影響，發現兩天的短期睡眠剝奪可以降低胰島素敏感性，間接影響了人體的糖代謝能力，因此我們可以推測慢性失眠患者和健康人體內與衰老、抗藥性、氨基酸代謝等功能基因相關的菌群種屬相對豐度或許也存在差異，本次基于picrust2 功能基因預測結果并未顯示出慢性失眠組和正常組的腸道菌群功能相關基因的顯著區別，可能存在樣本量較小和地區差異等限制因素。

失眠癥是否直接導致腸道微生物群的微生態失調尚不清楚。隨機森林分析等統計方法能夠以較高的預測精度和預測效率識別特征生物標志物，尤其適用于基于腸道微生物群的疾病預測和診斷。本研究中隨機森林模型確定了一個關鍵的細菌分類群（毛螺菌科），它不僅與臨床數據密切相關，而且在腸道生態網絡中起著關鍵作用，可作為識別失眠患者的潛在生物標志物。

4 結 論

本研究中利用前沿的生物信息學算法，證明了失眠與正常健康之間的差異，反映了魯北地區失眠人群的微生物群落組成。本研究表明失眠人群存在腸道微生物多樣性的改變，魯北地區失眠人群存在梭桿菌門、厚壁菌門及擬桿菌門的豐度相對的改變，而且我們也確定了毛螺菌科作為潛在生物標記物的可能性，雖然上述方法僅基于生物信息學分析，但結果具有一定的參考價值，后續研究可擴大樣本量進一步驗證。這將為利用腸道微生物群的信息開發新的治療策略，打開新的視角。

倫理學聲明：本研究方案經由濱州醫學院附屬醫院倫理委員會審批（批號：LW-13），患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李東陽負責設計論文框架、起草論文；白玉負責數據收集、統計學分析、繪制圖表；郭澳負責實驗操作、研究過程的實施；馬文彬負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。