冷凍豬肉食品中金黃色葡萄球菌的定性檢測方法

慕禮霞 賀治芬

摘 要：目的：分析冷凍豬肉食品中金黃色葡萄球菌的污染情況。方法：2023年7—12月，隨機(jī)抽選A市冷凍豬肉食品150份為研究樣本。樣本處理后分離菌株并培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭染色和血漿凝固酶試驗。觀察金黃色葡萄球菌的生物學(xué)性狀，統(tǒng)計冷凍豬肉樣本中金黃色葡萄球菌的檢出情況。結(jié)果：28份樣本受到金黃色葡萄球菌污染，即金黃色葡萄球菌陽性檢出率為18.67%。不同來源樣本中，來源于農(nóng)貿(mào)市場的樣品陽性檢出率為26.39%，高于商超的11.54%；不同類型樣本中，純?nèi)忸悩悠逢栃詸z出率為30.00%，高于排骨類和臟器類的12.00%、14.00%；不同冷凍時間樣本中，冷凍1、2、3個月的樣品陽性檢出率分別是17.74%、18.75%和20.00%。結(jié)論：農(nóng)貿(mào)市場中的純?nèi)忸惱鋬鲐i肉食品，其金黃色葡萄球菌污染情況較嚴(yán)重，提示相關(guān)管理部門加強(qiáng)監(jiān)管，以保障食品安全。

關(guān)鍵詞：冷凍豬肉；金黃色葡萄球菌；分離培養(yǎng)；定性檢測；市場監(jiān)管

Qualitative Detection Method for Staphylococcus aureus in Frozen Pork Food

Abstract： Objective： To analyze the contamination of Staphylococcus aureus in frozen pork food. Method： From July to December 2023， 150 frozen pork foods from city A were randomly selected as research samples. After sample processing， isolate the strains and culture them for Gram staining and plasma coagulation enzyme test. Observe the biological characteristics of Staphylococcus aureus and count the detection of Staphylococcus aureus in frozen pork samples. Result： 28 samples were contaminated with Staphylococcus aureus， with a positive detection rate of 18.67%. Among samples from different sources， the positive detection rate from agricultural markets was 26.39%， higher than the 11.54% from supermarkets; in different types of samples， the positive detection rate of pure meat is 30.00%， which is higher than the 12.00% and 14.00% of pork ribs and organs; the positive detection rates for samples frozen for 1， 2， and 3 months at different freezing times were 17.74%， 18.75%， and 20.00%， respectively. Conclusion： The contamination of Staphylococcus aureus in pure meat frozen pork products in agricultural markets is severe， which suggests that relevant management departments should strengthen supervision to ensure food safety.

Keywords： frozen pork; Staphylococcus aureus; isolation and cultivation; qualitative testing; market regulation

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于革蘭陽性菌的一種，在自然界中分布廣泛。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的致病力，不僅會造成醫(yī)院感染和社區(qū)感染，也是常見的食源性致病菌[1]。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌；我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發(fā)生，在所有細(xì)菌性食物中毒事件中占比約20%[2-3]。近年來，人們的生活水平提高，飲食上的消費需求日益增加，豬肉已經(jīng)成為餐桌上最普遍的食品，而金黃色葡萄球菌就是污染豬肉的致病菌之一，為人們的飲食安全帶來隱患。現(xiàn)有研究中，冷凍豬肉食品中也有檢測出金黃色葡萄球菌的情況[4]。本研究選取A市的冷凍豬肉食品為對象，對金黃色葡萄球菌開展定性檢測，為相關(guān)防控管理工作提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

2023年7—12月，從A市隨機(jī)抽選冷凍豬肉食品150份為研究樣本。來源于農(nóng)貿(mào)市場72份、商超78份；純?nèi)忸?0份、排骨類50份、臟器類50份；冷凍時間1個月62份、2個月48份、3個月40份；單個樣本重量在100～500 g。在無菌條件下取樣后，使用無菌袋封裝，在-12 ℃下冷藏，及時送往實驗室檢測。

1.1.2 試劑與儀器

無菌氯化鈉肉湯溶液（濃度7.5%），北京三藥科技有限公司生產(chǎn)；血瓊脂和Baird-Parker培養(yǎng)基，招遠(yuǎn)拓普生物工程公司生產(chǎn)；革蘭氏染液試劑盒，北京奧博星生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

電子秤、無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)器、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、一次性試管等。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

從150份原始樣本中，使用電子秤分別稱取25 g裝入無菌均質(zhì)袋，編號為001#～150#。向袋中加入225 mL無菌生理鹽水，利用均質(zhì)器拍打2 min，使菌體分布到溶液中得到樣品溶液。取5 mL樣品溶液，接種在50 mL的無菌氯化鈉肉湯溶液中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng)

培養(yǎng)結(jié)束后，使用接種環(huán)蘸取樣品溶液，并接種到血瓊脂和Baird-Parker培養(yǎng)基上，注意進(jìn)行Z字形劃線操作。然后將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為37 ℃，血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)22 h，Baird-Parker培養(yǎng)基培養(yǎng)46 h。

1.2.3 革蘭染色

在血瓊脂和Baird-Parker培養(yǎng)基上，選擇典型菌落涂片，使用革蘭氏染液試劑盒染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.4 血漿凝固酶試驗

選擇典型菌落接種到浸液肉湯中，在37 ℃下培養(yǎng)22 h；然后取0.5 mL菌液加入凍干兔血漿管內(nèi)，混勻后在37℃下培養(yǎng)6 h。在此期間，每30 min觀察一次，若發(fā)生凝固（試管傾斜或倒置時出現(xiàn)凝塊）或半凝固，則判定為陽性；若未發(fā)生凝固則一直觀察，直至達(dá)到6 h培養(yǎng)時間依然未凝固，則判定為陰性[5]。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察金黃色葡萄球菌的生物學(xué)性狀，包括菌落形態(tài)、革蘭染色特征和血漿凝固酶試驗結(jié)果。②統(tǒng)計冷凍豬肉樣本中金黃色葡萄球菌的檢出情況，對比不同來源、不同類型、不同冷凍時間的樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)性狀

2.1.1 菌落形態(tài)

所有樣本中有28份樣本中分離的菌株，在血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形、白色或金黃色，且表面濕潤；在Baird-Parker培養(yǎng)基上的菌落呈黑灰色、邊緣帶透明光圈，且有一定硬度，以上形態(tài)特征和金黃色葡萄球菌的特性一致。

2.1.2 革蘭染色特征

該28份樣本中分離的菌株，經(jīng)革蘭染色后呈現(xiàn)出青紫色，符合革蘭陽性菌的特征。在顯微鏡下觀察，可見菌株呈圓形串狀，沒有莢膜和芽孢結(jié)構(gòu)。

2.1.3 血漿凝固酶試驗結(jié)果

該28份陽性樣本中分離的菌株，血漿凝固酶試驗結(jié)果均為陽性。

綜合以上結(jié)果，可以判定28份樣本受到金黃色葡萄球菌污染，即金黃色葡萄球菌陽性檢出率為18.67%。

2.2 金黃色葡萄球菌的檢出情況

2.2.1 金黃色葡萄球菌陽性樣本的分布

150份冷凍豬肉樣本中，共計檢出金黃色葡萄球菌污染28份，陽性樣本的分布情況見表1。

2.2.2 不同來源樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率

不同來源樣本中均檢出金黃色葡萄球菌陽性，其中來源于農(nóng)貿(mào)市場的樣本陽性檢出率為26.39%，高于來源于商超的樣本為11.54%。見表2。

2.2.3 不同類型樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率

不同類型樣本中均檢出金黃色葡萄球菌陽性，其中純?nèi)忸悩颖镜年栃詸z出率為30.00%，高于排骨類和臟器類的12.00%、14.00%。見表3。

2.2.4 不同冷凍時間樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率

不同冷凍時間樣本中均檢出金黃色葡萄球菌陽性，冷凍1、2、3個月的樣本陽性檢出率分別是17.74%、18.75%和20.00%。見表4。

3 結(jié)論與討論

3.1 金黃色葡萄球菌致病特點

金黃色葡萄球菌多呈球狀或橢圓形，聚集排列類似葡萄串，可產(chǎn)生黃色的脂溶性色素，在血平板上的菌落呈金黃色。相關(guān)研究證實，金黃色葡萄球菌對干燥、熱、鹽等具有較強(qiáng)抵抗力，其在干燥的膿液中可存活2～3個月，在60 ℃環(huán)境中可存活

1 h，在10%的氯化鈉溶液中能長期存活并繁殖[6]。該細(xì)菌不僅能寄居在人體皮膚表面，還會引起食物中毒，致病因子是病原體在食物中繁殖產(chǎn)生的腸毒素，導(dǎo)致人體出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀。結(jié)合大量文獻(xiàn)成果，若人體在進(jìn)食24 h后出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等情況，懷疑是食物中毒，應(yīng)及時到醫(yī)院消化內(nèi)科就診[7-8]。近年來，隨著人們的生活和飲食習(xí)慣改變，因食物污染、飲食不潔等引起的金黃色葡萄球菌中毒事件的發(fā)生率也在提高，提示消費者加以關(guān)注。

3.2 金黃色葡萄球菌的檢測方法

目前，對于食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法，主要是涂片鏡檢和分離培養(yǎng)。其中，涂片鏡檢是觀察細(xì)菌的形態(tài)、排列特征和染色情況，可對金黃色葡萄球菌進(jìn)行初步判定，該方法操作簡單、用時短，但無法區(qū)分是否是致病菌。分離培養(yǎng)是將標(biāo)本接種在培養(yǎng)基中，觀察菌落特征進(jìn)行鑒別，該方法的精準(zhǔn)度高，但用時較長，一般需要3～5 d完成。賀生芳等[9]依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016），對兩份樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的定性檢測，最終實驗室的能力驗證結(jié)果為“滿意”。

此外，血漿凝固酶試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、核糖體分型檢測等，也是目前常用的檢測技術(shù)。其中，血漿凝固酶試驗可區(qū)分金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌；ELISA法是國際推薦的腸毒素分型檢測技術(shù)，具有檢測方便、靈敏度高的優(yōu)點；PCR法不僅操作簡單、用時短，而且靈敏度和特異性高。

本文對冷凍豬肉中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陽性檢出率為18.67%。分析認(rèn)為，金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在低溫冷凍條件下部分菌株處于亞致死狀態(tài)，因此冷凍豬肉食品也可能存在污染情況。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)以下特征：①不同冷凍時間樣本中，金黃色葡萄球菌的檢出率無明顯差異；②來源于農(nóng)貿(mào)市場的樣本陽性檢出率明顯高于商超樣本，純?nèi)忸悩颖镜年栃詸z出率明顯高于排骨類和臟器類。造成這一情況的原因可能和生產(chǎn)加工、冷凍環(huán)境、衛(wèi)生管理等因素有關(guān)。

3.3 相關(guān)建議

結(jié)合本次研究結(jié)果，提示生產(chǎn)者、消費者和管理者加強(qiáng)防治力度，以保障飲食安全。①生產(chǎn)者層面，加強(qiáng)豬的飼養(yǎng)、屠宰、加工、冷藏及銷售各環(huán)節(jié)的監(jiān)管，嚴(yán)格落實檢疫制度，實現(xiàn)豬肉從加工到餐桌全過程安全質(zhì)量控制，消除金黃色葡萄球菌污染隱患。②消費者層面，要求民眾增強(qiáng)飲食安全意識，從正規(guī)渠道購買豬肉食品，仔細(xì)觀察評估豬肉的品質(zhì)；并采用科學(xué)的烹飪方法，食用前必須充分加熱燒熟，加強(qiáng)衛(wèi)生管理，杜絕金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒條件。③管理者層面，要落實市場監(jiān)管工作，建立冷凍豬肉食品中金黃色葡萄球菌的危險性評估模型。要加大宣傳教育力度，尤其餐飲企業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)要落實自身職責(zé)，發(fā)揮出防治管理合力。

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