HPLC法測定參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量

2024-04-28 11:15:36路麗張洪坤黃玉瑤郝建新仲勇成王利勝董翼虎高貫彪

中國民族民間醫藥·上半月 2024年2期

路麗張洪坤黃玉瑤郝建新仲勇成王利勝董翼虎高貫彪

【摘?要】?目的：建立HPLC法測定參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量。方法：采用色譜柱ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）為流動相等度洗脫；檢測波長403 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min。結果：羥基紅花黃色素A在0.0480 ～0.7196 μg范圍內線性關系良好，平均加樣回收率（n=9）為101.74%， RSD值為1.6%。結論：該方法操作簡便、準確、重復性好，測定結果穩定，可以作為參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量測定方法。

【關鍵詞】?參梅養胃顆粒（無蔗糖）；羥基紅花黃色素A；含量測定；HPLC法

【中圖分類號】R284.1???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2024）03-0041-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403010

Determination of Hydroxysafflower Yellow A in Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose） by HPLC

LU Li1，2?ZHANG Hongkun1，2*?HUANG Yuyao1?HAO Jianxin3?ZHONG Yongcheng1

WANG Lisheng4?DONG Yihu5?GAO Guanbiao2

1. Sichuan Haoyun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangyuan 628017，China;

2.Bozhou Huqiao pharmaceutical industy limited company，Bozhou 236800， China;

3.Guangzhou Heyi Medical Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510970，China;

4.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006，China;

5.Guangyuan Drug Inspection and Testing Center， Guangyuan 628017，China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.Methods Chromatographic column ODS-C₁₈（4.6mm × 250mm，5 μm）， elute with methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid solution （26：2：72） as the flow equivalent， detection wavelength： 403 nm，column temperature 25℃，injection volume 10 μL， the flow rate is 1.0 mL/min.Results Hydroxysafflower yellow A was 0.0480-0.7196 μg the linear relationship within the range of is good， the average recovery rate（n=9） is 101.74%， and the RSD value is 1.6%.Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and stable. It can be used for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.

Keywords：Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose）;Hydroxysafflower Yellow A;Content Determination;HPLC

參梅養胃顆粒（無蔗糖）由北沙參、山楂、烏梅、紅花、丹參等十一味中藥組成，具有養陰和胃之功效。臨床用于胃痛灼熱、嘈雜似饑、口咽干燥、大便干結、淺表性胃炎、胃陰不足型慢性胃炎及各種胃部不適癥^［1］。方中北沙參、烏梅養陰生津止渴為君藥；蒲公英清熱解毒，紅花、丹參、莪術、當歸活血化瘀、涼血止痛、潤腸通便為臣藥；白芍、甘草養陰柔肝緩急止痛為佐；山楂、土木香健脾消食、行氣止痛為使，諸藥合用，共奏養陰和胃活血止痛之功，且治療效果明顯，值得臨床推廣使用。

現行參梅養胃顆粒質量標準中只有理化鑒別項，無含量測定項目，無法有效控制藥物的內在質量^［2］。有研究者^［5-9］測定參梅養胃顆粒中的芍藥苷、丹酚酸B、甘草苷和甘草酸銨等指標的含量，但是尚未有報道其中有效成分羥基紅花黃色素A的含量測定研究。紅花為方中臣藥，具有活血化瘀、涼血止痛之功效，羥基紅花黃色素A為其主要藥效成分，具有抗炎鎮痛的作用^［3-4］。筆者通過一系列的實驗研究，首次運用HPLC法制定了參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量測定方法。

1?儀器與材料

1.1?儀器?安捷倫1260液相色譜系統；BP211D電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，d=0.1 mg）；JM-2CD-40液晶單頻超聲波清洗儀器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；AXTG16B醫用離心機（鹽城市安信實驗儀器有限公司）。

1.2?試藥?羥甲基紅花黃色素A（批號：111637-202111，含量96.8%，中國食品藥品檢定研究院）甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；水為超純水，其它試劑為分析純。

樣品：北沙參（批號220201）、山楂（批號220201）、烏梅（批號220301）、莪術（批號220201）、土木香（批號220201）、蒲公英（批號220201）、丹參（批號220301）、甘草（批號220302）、白芍（批號220201）、當歸（批號220301）均購于四川省泓圃藥業有限公司，上述藥材均經四川豪運藥業股份有限公司張洪坤副主任中藥師鑒定為正品。

2?方法與結果

2.1?色譜條件?色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；檢測波長：403 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。理論板數按羥基紅花黃色素A峰計算應不低于3000。

2.2?對照品溶液的制備?取羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成每1 mL含0.125 mg的溶液，即得。

2.3?供試品溶液的制備?取本品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4?方法學考察

2.4.1?專屬性

2.4.1.1?溶劑空白溶液制備?25%甲醇溶液，濾過，取續濾液，即得。

2.4.1.2?陰性樣品溶液制備（空白溶液）?取樣品約2 g（除紅花），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4.1.3?輔料空白溶液的制備?取本品的輔料（糊精）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

取“2.2”項下對照品溶液，“2.3”項下供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、溶劑空白溶液、陰性樣品溶液及輔料空白溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結果空白溶液及陰性樣品均無干擾，表明方法專屬性良好。如圖1所示。

2.4.2?線性關系考察?對照品工作曲線溶液：分別移取“2.1”項下的對照品儲備液0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.2 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為每1 mL含羥基紅花黃色素A 5 μg、12.5 μg、25 μg、40 μg、50 μg、75 μg、100 μg以及母液125 μg的系列對照品溶液。

精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，每個樣品測定3次；最后以測得的響應信號對被測物的濃度函數作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程Y=0.0349X-0.0113（R²=1）。結果表明，羥基紅花黃色素A濃度在0.0480～0.7196 μg范圍內，與峰面積線性關系良好。

2.4.3?精密度試驗?取“2.4.2”項下25 μg/mL濃度的對照品溶液，按“2.1”項下色譜方法連續進樣6次測定，記錄羥基紅花黃色素A的峰面積，結果峰面積RSD值為0.4%，說明儀器精密度良好。

2.4.4?重復性試驗?取同一批樣品6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。計算6份樣品的平均含量為0.48 mg/g，RSD值為0.5%，結果表明該方法的重復性良好。

2.4.5?加樣回收率試驗?取已知羥基紅花黃色素A含量的樣品約1 g，共9份，每3份為一組，共3組，每組加入羥基紅花黃色素A對照品，加入量與所取供試品（1g樣品）中待測定成分量之比分別為（1.5∶1）、（1∶1）、（0.5∶1），按“2.3”項下制備供試品溶液的方法制備9份供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。計算平均回收率為101.74%， RSD值為1.6%。結果符合相應濃度下的準確度的要求。實驗結果見表1。

2.4.6?檢測限和定量限?配制一系列低濃度的對照品溶液，分別為0.0999 μg/mL、 0.1998 μg/mL、0.2997 μg/mL、 0.3996 μg/mL、 0.4496 μg/mL、0.4995 μg/mL。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定；記錄峰高值。以樣品峰高高度明顯大于2～3倍溶劑空白樣品基線高度的相應濃度（或）量作為檢出限，以10倍以上空白樣品噪音基線高度的相應量為定量限。結果顯示，檢測限為0.000999 μg，定量限為0.004496 μg。

2.4.7?穩定性試驗?取同一份供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進樣分析，考察供試品溶液穩定性。結果，供試品溶液0～24 h測定的羥基紅花黃色素A色譜峰面積RSD為2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.8?耐用性考察?對不同色譜柱、不同柱溫、不同流速、不同檢測波長及不同濃度流動相進行分析考察含量測定方法耐用性。結果顯示各考察因素下的目標峰分離度、對稱因子、靈敏度、理論塔板數等均符合要求，且不同考察因素下測定羥基紅花黃色素A含量的RSD分別為2.0%、2.3%、3.2%、1.2%、1.2%，表明該含量測定方法的耐用性良好。結果見表2。

2.5?含量測定?取不同來源和批次的參梅養胃顆粒（無蔗糖），按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算樣品中羥基紅花黃色素A的含量。結果見表3。

3?討論

3.1?供試品溶液的制備?在參梅養胃顆粒（無蔗糖）供試品溶液的制備中，以羥基紅花黃色素A的含量為指標，系統考察了提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）、提取方式（超聲、回流、冷浸）、提取次數（超聲處理1次、2次、3次）和時間（40 min、50 min、60 min）對提取率的影響，測定結果顯示，采用25%甲醇 50 mL超聲處理（功率 480 W，頻率 40 kHz）40 min的方法，提取效率較高，同時提取時間較短，且方法操作簡便，故選用此制備方法。

3.2?檢測波長的選擇?在190～600 nm的紫外區進行在線檢測，羥基紅花黃色素A在403 nm處有最大吸收，峰純度因子996，因此選擇403 nm作為參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A指標成分含量測定的檢測波長。

本實驗建立HPLC法測定參梅養胃顆粒（無蔗糖）的羥基紅花黃色素A的含量，該方法操作簡便、準確、重復性好、耐用性好，測定結果穩定，可以作為參梅養胃顆粒（無蔗糖）的羥基紅花黃色素A含量的測定方法。由含量測定結果可知，自制樣品的羥基紅花黃色素A含量為2.65～3.15 mg/袋，市售樣品中的羥基紅花黃色素A含量為0.00～0.03 mg/袋，兩者含量存在顯著差異，考慮跟生產工藝以及羥基紅花黃色素A的穩定性差有關。在參梅養胃顆粒（無蔗糖）的生產過程中涉及加熱提取濃縮等步驟，此過程會導致羥基紅花黃色素A產生一定的分解從而影響其含量。有研究^［10-12］表明光照、溫度、濕度等對羥基紅花黃色素A的穩定性影響比較大，當溫度高于60 ℃，加熱一定時間后，羥基紅花黃色素A就會發生水解；在避光條件下，羥基紅花黃色素A有較好的穩定性。所以在參梅養胃顆粒（無蔗糖）的生產過程中需要特別注意生產工藝過程中加熱提取的溫度等參數對其含量的影響，同時對原料的質量把控也是至關重要的。

考慮參梅養胃顆粒的現行質量標準中只有理化鑒別項，無含量測定項目，無法有效控制藥物的內在質量，所以質量標準的提高迫在眉睫，建立有效成分的含量測定指標有助于控制產品質量，由此可見對參梅養胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的質量標準建立具有重要意義。

參考文獻

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