HPLC法測定小兒肺熱咳喘口服液中3種防腐劑的含量

李兵蘭 王娟 何奕熹

【摘?要】?目的：建立小兒肺熱咳喘口服液中3種防腐劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長320 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在5～60 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系（r>0.999），平均加樣回收率分別為99.72%（RSD=1.57%，n=6），97.30%（RSD=1.70%，n=6），101.37%（RSD=0.99%，n=6）；苯甲酸、山梨酸、糖精鈉精密度試驗的RSD分別為0.07%、0.21%、0.18%。結(jié)論：實驗采用的HPLC法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于液體口服制劑中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量測定。

【關(guān)鍵詞】?小兒肺熱咳喘口服液；苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；高效液相色譜法；含量測定

【中圖分類號】R284.1???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2024）03-0037-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403009

Determination of 3 Preservatives in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution by HPLC

LI Binglan?WANG Juan?HE Yixi

Honghe Institute for Food and Drug Control， ?Mengzi 661199， China

Abstract：Objective To establish a method for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution.Methods The determination by high performance liquid chromatography（HPLC） was performed on Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid（19∶81，V/V）at the flow rate of 1 mL/min; the detection wave length was set at 320 nm， and sample size was 10 μL; the column temperature was 30 ℃.Results The linear range of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium were 5-60 μg/mL（r>0.999）. The average recovery rate was 99.72%， 97.30% and 101.37%. and RSD were 1.57%， 1.70% and 0.99%（n=6）. The RSD of precision test were 0.07%， 0.21% and 0.18%. Conclusion The HPLC method is simple， accurate， specific and repeatable which could be used for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution.

Keywords：Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution; Benzoic Acid; Sorbic Acid; Saccharin Sodium; HPLC; Content Determination

小兒肺熱咳喘口服液收載于2020版《中國藥典》一部，是由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草、金銀花、連翹、知母、黃芩、板藍(lán)根、麥冬、魚腥草等十一味中藥組成，具有清熱解毒、宣肺化痰的功效，常用于小兒熱邪犯肺所致發(fā)熱、咳嗽等^［1］。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是常見的防腐劑，在中藥口服液中添加防腐劑可以起到防止微生物污染的作用^［2-3］。但添加過量的防腐劑會對人體產(chǎn)生毒副作用，文獻(xiàn)報道^［4-5］苯甲酸能誘發(fā)相關(guān)性水腫和急性蕁麻疹，苯甲酸與糖精鈉對細(xì)胞的毒性作用均表現(xiàn)為相加作用，中國藥典明確規(guī)定苯甲酸和山梨酸用于中藥合劑（口服液）中的用量不得超過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計）^［6］，尚無根據(jù)不同口服液體制劑制定不同防腐劑添加量的標(biāo)準(zhǔn)。為了嚴(yán)格控制防腐劑地使用，保證用藥安全，本文探索了小兒肺熱咳喘口服液中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的HPLC測定方法。

1?材料與方法

1.1?儀器?Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司，G1311C四元泵，G1329B自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314B紫外檢測器）。

1.2?試藥?乙腈為色譜純，廠家為賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸為分析純，廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；水為超純水。苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號：21001；含量：1.00 mg/mL）、山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號：21001；含量：1.00 mg/mL）、糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號：19001；含量：1.00 mg/mL）均購自中國計量科學(xué)研究院；小兒肺熱咳喘口服液14個批號均來自同一廠家，批號分別為202111020、202103011、202112059、202101107、202001036、202106003、202101107、202111079、202103075、202101106、202107021、202107012、202112059、202112116，規(guī)格為每1 mL相當(dāng)于飲1.77 g，樣品來源為省級評價性抽樣。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱：樣品經(jīng)處理后采用HPLC法，色譜柱為Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）；流速：1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備?精密量取苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各2 mL，置20 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，混勻，制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液1。精密量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液1至5 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各3 mL，置20 mL棕色容量瓶中，加5%甲醇溶解并定容，混勻，制成濃度為150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液2，用于回收率試驗。精密量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液1至5 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/mL）。

2.3?供試品溶液的制備?精密量取樣品1 mL，置100 mL容量瓶中，加入5%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液。

2.4?陰性對照溶液制備?按小兒肺熱咳喘口服液處方比例和制備工藝自制不含防腐劑的小兒肺熱咳喘口服溶液作為陰性對照溶液。

2.5?專屬性考察?分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示，待測成分與其他物質(zhì)分離良好，分離度均大于1.5，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的理論板數(shù)分別為22216、22190、20325。陰性對照溶液色譜圖在待測成分相應(yīng)位置無干擾峰，表明其它成分對待測成分的測定無干擾。

2.6?線性關(guān)系考察?精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1（100μg/mL）0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、4 mL、6 mL分別置于10 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。分別以苯甲酸、山梨酸、糖精鈉溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果表明苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在5～60 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。如圖2所示、見表1。

2.7?精密度試驗?取標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/mL），按“2.1”項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的苯甲酸峰面積RSD分別為為0.07%（n=6）、0.21%（n=6）、0.18%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.8?穩(wěn)定性試驗?取批號為202111020的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h，32 h、36 h各進(jìn)樣1次，測定峰面積。結(jié)果苯甲酸峰RSD為0.52%（n=13），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9?重復(fù)性試驗?取批號為202111020的供試品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣測定。結(jié)果苯甲酸的平均含量為2.4848 mg/mL，RSD為0.46%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.10?回收率試驗?分別精密量取5 mL批號為202111020的供試品6份置于100容量瓶，加入5%甲醇溶液稀釋至刻度，作為供試品溶液，分別量取上述供試品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液2，加入5%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。將處理好的供試品溶液按上述色譜條件測定，計算回收率，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的平均回收率分別為99.72%（RSD=1.57%，n=6），97.30%（RSD=1.70%，n=6），101.37%（RSD=0.99%，n=6）。結(jié)果見表2。

2.11?樣品含量測定?取14批小兒肺熱咳喘口服液樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量。含量測定結(jié)果見表3。

3?討論

考察甲醇-0.15%乙酸銨溶液對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的分離效果^［7］，發(fā)現(xiàn)苯甲酸峰不能與相鄰峰完全分離，而使用乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）苯甲酸峰能與相鄰峰有較好分離度，且峰型較好，因此本方法采用乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）作為流動相。苯甲酸微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，考察5%甲醇溶液、10%甲醇溶液作為稀釋溶劑，5%甲醇溶液、10%甲醇溶液溶解的樣品穩(wěn)定性均良好，但是隨著甲醇濃度的增大，溶解樣品的過程中會產(chǎn)生沉淀，所以本法采用5%甲醇溶液做為溶劑。

文獻(xiàn)報道^［4］苯甲酸鈉使蕁麻疹及新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險增加，特別是有高膽紅素血癥、多動癥的新生兒或兒童應(yīng)謹(jǐn)慎使用。從檢驗結(jié)果看，14批小兒肺熱咳喘口服液的苯甲酸含量為0.24%～0.25%，山梨酸、糖精鈉均未檢出，均在中國藥典規(guī)定的限度范圍內(nèi)，說明防腐劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉項目廠家嚴(yán)格按照藥典標(biāo)準(zhǔn)投料。本方法可以在30 min內(nèi)測定其含量，方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，為其含量的分析提供了理想的方法，可以用于防腐劑投料的監(jiān)控。研究中藥小兒口服液體制劑的防腐劑投入量，盡量減少防腐劑使用量，提高兒童制劑的安全性。

參考文獻(xiàn)

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：565-566.

［2］袁媛，鐘水生，張華鋒，等.HPLC法同時測定小兒咳喘靈口服液中7中防腐劑的含量［J］.中國藥師，2020，23（12）：2473-2476.

［3］龍凱，王娟.高效液相色譜法測定治咳川貝枇杷露中苯甲酸、羥苯乙酯含量［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2021，30（6）：43-45.

［4］秦輝，王娜，王賓，等.中成藥中的輔料使用報告評價與不良反應(yīng)分析［J］.海峽藥學(xué)，2021，33（2）：214-216.

［5］王思文，鞏江，高昂，等.防腐劑苯甲酸的藥理及毒理學(xué)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（30）：16845-16846.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：通則26.

（收稿日期：2023-05-05?編輯：陶希睿）

作者簡介：李兵蘭（1986—），女，瑤族，本科，主管藥師，研究方向為藥品質(zhì)量分析。E-mail：310409108@qq.com