兩個(gè)茶樹(shù)品種維生素B6代謝通路的轉(zhuǎn)錄組分析

胡志宏

（百色市茶業(yè)發(fā)展中心，廣西 百色 533000）

“凌云白毫茶”原名白毛茶，因其葉背長(zhǎng)滿白毫而得名，據(jù)考證有一千多年的生長(zhǎng)歷史，是全國(guó)第一批認(rèn)定的國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種之一[1]。《中國(guó)名茶志》記載：凌云白毛茶為歷史名茶，創(chuàng)于清乾隆以前，原產(chǎn)于凌云縣。“凌云白毫茶”因其葉背長(zhǎng)滿白毫而得名，主產(chǎn)于凌云縣四季云霧繚繞的岑王老山、青龍山一帶[2]。得天獨(dú)厚的自然環(huán)境，使凌云白毫茶以色翠、毫多、香醇、味濃、耐泡五大特色成為中國(guó)名茶中的新秀[3]。“凌云白毫茶”葉芽肥壯，持嫩性好，加工后條索緊結(jié)微曲、白毫顯露，香氣馥郁持久、回味甘甜、板栗香型，而且適宜性強(qiáng)，目前已開(kāi)發(fā)出綠、紅、白、青、黃、黑等六大茶類，在國(guó)內(nèi)外享有較高的聲譽(yù)。

從1995年確定為優(yōu)良單株，歷經(jīng)28年的努力，廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科研人員選育的“桂熱2號(hào)”茶樹(shù)新品種于2023年正式獲得國(guó)家級(jí)優(yōu)良品種登記[4]。“桂熱2號(hào)”屬喬木型大葉類，偏早芽，特顯毫，樹(shù)勢(shì)強(qiáng)且適制綠茶、紅茶及黃茶，適宜在廣西地區(qū)栽培，現(xiàn)已在崇左市、百色市、柳州市等地推廣[5]。“桂熱2號(hào)”制作的綠茶條索緊結(jié)，外形肥壯，香氣持久，有栗香，滋味鮮爽醇厚；制紅茶，外形顯毫，烏潤(rùn)、勻凈、香氣持久，滋味濃強(qiáng)、鮮爽。“桂熱2號(hào)”所制茶產(chǎn)品曾7次在“中茶杯”“國(guó)飲杯”、中國(guó)黃茶斗茶大賽等全國(guó)性茶葉評(píng)比中榮獲特等獎(jiǎng)、一等獎(jiǎng)、金獎(jiǎng)，是極具推廣潛力的廣西本土茶葉品種。“桂熱2號(hào)”茶樹(shù)品種的優(yōu)良特性將有利于其在廣西茶區(qū)大面積推廣，對(duì)廣西茶園品種結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整及茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有良好的促進(jìn)作用，同時(shí)可新增廣西茶產(chǎn)品的種類，提升產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量，促進(jìn)茶企及茶農(nóng)增收[6]。

維生素B6（vitamin B6，VB6）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)30年代，屬于B族的水溶性維生素，遇光或堿易被破壞且不耐高溫[7]。VB6是生物體必需的微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與人體重要細(xì)胞代謝，同時(shí)具有抗氧化、抗病毒及抗炎等功能，對(duì)心腦血管疾病、糖尿病、癌癥和神經(jīng)性疾病等多種疾病治療至關(guān)重要，在食品和制藥行業(yè)中具有極高商業(yè)價(jià)值[8]。Chen CC等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在PDXK或PLP水平上，維生素B6的藥理學(xué)阻斷明顯有著抗白血病活性，維生素B6代謝通路在開(kāi)發(fā)抗白血病的藥物中有著重要的研究?jī)r(jià)值。張憶美[10]研究表明，對(duì)輕、重度膿毒癥大鼠的6小時(shí)和12小時(shí)各組間的差異代謝物通過(guò)代謝途徑分析，結(jié)果均與維生素B6代謝途徑相關(guān)，進(jìn)一步證明了維生素B6在預(yù)防膿毒癥腦功能障礙中有一定的作用。

轉(zhuǎn)錄組分析在破譯基因結(jié)構(gòu)和功能，識(shí)別細(xì)胞、生理生化甚至生物系統(tǒng)基礎(chǔ)的遺傳網(wǎng)絡(luò)以及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在茶樹(shù)功能基因探索[11]、制茶工藝[12]、品質(zhì)及功效研究[13-14]等方面有著廣泛的應(yīng)用。目前，關(guān)于“凌云白毫茶”和“桂熱2號(hào)”的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究報(bào)道較少，基于此，本研究以這兩個(gè)茶樹(shù)品種為試驗(yàn)材料，進(jìn)行維生素B6代謝通路的轉(zhuǎn)錄組分析，探索“凌云白毫茶”和“桂熱2號(hào)”在維生素B6上的差異，以期為二者的功能開(kāi)發(fā)及深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集地點(diǎn)：廣西百色市凌云縣廣西正道茶業(yè)有限公司茶園

采集時(shí)間：2023年7月

采集對(duì)象：“凌云白毫茶”茶樹(shù)枝條上的一芽二葉，三個(gè)重復(fù)，樣本編號(hào)為A；“桂熱2號(hào)”為嫁接茶樹(shù)（砧木為“凌云白毫茶”），同樣為茶樹(shù)枝條上的一芽二葉，三個(gè)重復(fù)，樣本編號(hào)為B。

1.2 試驗(yàn)方法

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將獲得的Clean Reads使用HISAT2[15]比對(duì)到參考基因組[16]以獲取在參考基因組或基因上的位置信息和測(cè)序樣本唯一的序列特征信息。然后對(duì)2個(gè)樣本的FPKM值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用DEseq軟件分析差異基因表達(dá)，將差異基因篩選后注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，并重點(diǎn)分析維生素B6代謝KEGG通路和進(jìn)行GSEA分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Microsoft Excel 2019軟件，轉(zhuǎn)錄組分析用R軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA分析

通過(guò)對(duì)樣本的PCA分析（主成分分析），可以反映不同樣本之間組成成分的差異。如圖1所示，樣本的第一主成分（PC1）為49.87%，第二主成分（PC2）為15%，第三主成分（PC3）為12.9%且兩個(gè)樣本在3D圖中存在明顯的空間距離，說(shuō)明兩個(gè)茶樹(shù)品種的基因組成有著顯著區(qū)別。

圖1 各組樣本基因的PCA得分圖

2.2 差異基因KEGG通路富集分析

生物體內(nèi)的不同基因產(chǎn)物通過(guò)相互作用行使生物學(xué)功能，對(duì)差異基因的通路注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。在A與B的比較中，有2219個(gè)差異基因被注釋到了138條通路中，這些通路主要包括類胡蘿卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黃素代謝、單萜生物合成、D-氨基酸代謝等途徑（圖2）。

圖2 樣本A和B差異基因KEGG富集圖

2.3 維生素B6代謝KEGG通路分析

在進(jìn)行KEGG富集分析之后，選取維生素B6代謝通路（ko00750）進(jìn)一步分析，共有4個(gè)酶和6個(gè)差異基因參與此通路。其中，一個(gè)差異基因?qū)?yīng)吡哆醛磷酸酶（EC:3.1.3.74），一個(gè)差異基因?qū)?yīng)吡哆胺5'-磷酸氧化酶（EC:1.4.3.5），一個(gè)差異基因?qū)?yīng)吡哆醛5'-磷酸合成酶pdxS亞基（EC:4.3.3.6），三個(gè)差異基因?qū)?yīng)吡哆醇4-脫氫酶（EC:1.1.1.65），酶和基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示，有2個(gè)上調(diào)基因，4個(gè)下調(diào)基因。圖3為差異基因參與的維生素B6代謝通路可視化。

表1 與維生素B6代謝通路相關(guān)的基因

圖3 維生素B6代謝通路的差異基因

2.4 維生素B6代謝KEGG通路GSEA分析

常規(guī)的基于超幾何分布的富集分析依賴于顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，容易遺漏部分差異表達(dá)不顯著但有重要生物學(xué)意義的基因。基因集富集分析（GSEA）[17]不需要指定明確的差異基因閾值，把基因按照在兩組樣本中的差異表達(dá)程度進(jìn)行排序，然后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)預(yù)先設(shè)定的基因集合是否在排序表的頂端或底端富集。GSEA分析可以有效解釋某個(gè)通路中既有上調(diào)基因又有下調(diào)基因時(shí)該通路總體上是被抑制還是被激活的狀態(tài)。

通過(guò)GSEA分析，發(fā)現(xiàn)維生素B6代謝KEGG通路的ES值（Enrichment Score富集得分值）為0.27，NES值（ES值標(biāo)準(zhǔn)化后的富集得分值）為1.16，NOM p-val值（p值，富集分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平）為0.22，F(xiàn)DR q-val值（對(duì)p值的校正）為0.44，F(xiàn)WER p-val值（總體錯(cuò)誤率P值）為1。從維生素B6代謝通路的背景基因聚類熱圖（圖4）中發(fā)現(xiàn)注釋到該通路的基因有43個(gè)（CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473、CSA021653、CSA033984、CSA011806、CSA011222、CSA021654、CSA004703、CSA004704、CSA011807、CSA004138、CSA029833、CSA011805、CSA005035、CSA029934、CSA035444、CSA025321、CSA016678、CSA000602、CSA031802、Novel.19988、CSA006642、CSA030934、CSA005036、CSA028404、CSA005241、CSA 036155、Novel.6649、CSA031803、CSA022002、CSA022003、CSA031801、CSA028518、CSA016826、CSA034003、CSA035284、CSA011220、CSA007728、CSA017295、CSA020372），占總背景基因數(shù)18858個(gè)的0.23%。其中，CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五個(gè)基因?yàn)楹诵幕颍谠撏分衅鸬捷^大的作用，貢獻(xiàn)較大（表2）。同時(shí)從GSEA富集分析結(jié)果圖6中可以看出B在折線圖中的折線和X坐標(biāo)軸形成的面積相較于A更大。綜上所述，A相比于B在維生素B6代謝KEGG通路中，整體上A受到了抑制，B得到了激活，B在該通路中更為活躍。

表2 維生素B6代謝通路的GSEA富集分析表y

圖4 維生素B6代謝通路的背景基因聚類熱圖

圖5 維生素B6代謝通路的GSEA富集分析結(jié)果圖

3 討論

維生素B6是一種低分子有機(jī)化合物，在促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)發(fā)育和維持正常生理功能上發(fā)揮著重要作用。維生素B6可作為輔酶參與氨基酸、碳水化合物、脂類及核酸代謝等140多種生化反應(yīng)。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，維生素B6還具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用。維生素B6缺乏與多種炎癥性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加有著密切聯(lián)系[18]。Mei M等[19]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌在VB6代謝過(guò)程中，醛氧化酶、磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶和吡哆胺5'-磷酸氧化酶的表達(dá)減少，其合成產(chǎn)物吡哆醛（VB6主要成分之一）和4-吡哆酸的表達(dá)減少，最終證明了VB6可改善慢性肝損傷的炎癥細(xì)胞侵襲、肝細(xì)胞水腫和變性。本研究中“凌云白毫茶”相比于“桂熱2號(hào)”的通路中的吡哆胺5'-磷酸氧化酶呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，共有2個(gè)上調(diào)基因，4個(gè)下調(diào)基因，且通過(guò)GSEA富集分析可以看出B在該通路中更為活躍。所以從維生素B6對(duì)茶葉的影響來(lái)看，推測(cè)出用“桂熱2號(hào)”制茶在藥用及保健功能上更有效果。

4 結(jié)論

本研究對(duì)兩個(gè)茶樹(shù)品種的維生素B6代謝通路進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，“凌云白毫茶”與“桂熱2號(hào)”相比，有2219個(gè)差異基因被注釋到了138條通路中，這些通路主要包括類胡蘿卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黃素代謝、單萜生物合成、D-氨基酸代謝等途徑。在維生素B6代謝KEGG通路（ko00750）分析中，共有4個(gè)酶和6個(gè)差異基因參與此通路（2個(gè)上調(diào)基因，4個(gè)下調(diào)基因）。通過(guò)GSEA分析，發(fā)現(xiàn)維生素B6代謝KEGG通路的ES值為0.27，NES值為1.16，NOM p-val值為0.22，F(xiàn)DR q-val值為0.44，F(xiàn)WER p-val值為1。該通路43個(gè)背景基因中的CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五個(gè)基因?yàn)楹诵幕颍摇肮馃?號(hào)”在該通路中顯得更為活躍。