《人源肺癌類器官培養技術規范》（T/SHSYCXH 12-2022）解析

文/許 俊 王萍萍 郭云峰 任 程

肺癌是全球最常見的癌癥，也是一種復雜的惡性疾病，在不同患者中表現出的表型和基因型呈多樣性，對精準醫療的使用提出了相當大的挑戰。由于肺癌是肺上皮細胞的致癌性、遺傳學的變化造成的，并且有不同的分子和病理組織學分型，因此，肺癌的突變模式非常復雜。此外，即便是具有相同組織學表型的肺癌也表現出分子生物學上的異質性，并且每種肺癌亞型都具有獨特潛在的突變。因此，建立一個模擬原始組織的形態學和基因組特征的臨床前模型來預測靶向治療的臨床結果是非常必要的，了解與肺癌的發生、進展和治療敏感性相關的遺傳改變，對于肺癌的治療意義非凡。

人源肺癌類器官（以下簡稱“肺癌類器官”）是通過肺癌腫瘤組織在體外進行三維（3D）培養產生的，構建成功率高，且能全面地反映患者腫瘤的形態和遺傳/表觀遺傳特征，與原始臨床標本表現出高度的基因型和表型一致性，對抗腫瘤藥物表現出模仿患者預期反應的反應，并在短時間內可用。肺癌類器官的培養，可以為藥物篩選和研發提供新的高性價比平臺，有望縮短新藥研發時間，提高新藥研發效率。

一、肺類器官培養技術與標準現狀

目前，肺類器官根據來源主要分為3種：成熟肺上皮干細胞來源的肺類器官、人類多能干細胞來源的肺類器官和肺癌類器官。肺癌類器官的探索經過了原代腫瘤細胞培養、腫瘤細胞間質細胞混合培養（2D—類器官）和肺癌類器官3個階段的探索。培養標本來源也從手術和穿刺標本，發展到可以通過循環腫瘤細胞、胸腔積液或支氣管肺泡灌洗液培養。肺癌類器官可由患者組織分離出來的腫瘤細胞生成。肺癌類器官培養的實現采用了多種培養方式，包括促人多能干細胞分化、調控原代細胞、肺癌細胞轉化和通過“條件重編程”方法增加對腫瘤活檢物培養的成功性等。有干性的細胞可以通過熒光激活細胞分選系統或磁珠抗體細胞分選系統進行分離，并在2D培養基或含有基質膜（Matrigel）的3D培養基中進行進一步培養。

肺癌類器官生物樣本庫的建立，對指導符合人種特性的肺癌治療和藥物研發具有不可替代的意義。具有特殊性肺癌生物樣本庫的建立，如早期肺癌生物樣本庫、轉移性肺癌樣本庫和肺癌瘤旁樣本庫等，有助于研究早期肺癌的演化機制、肺癌的轉移特性、肺癌和瘤旁組織的生物學特性等，有助于指導患者的個體化治療，推動臨床前藥物研發、肺癌發生、進一步演化和轉移的機制研究。

目前，肺癌類器官樣本庫建設需求旺盛。2020年起，每年涌現出超過50家類器官腫瘤藥敏檢測服務公司。但是，由于缺乏標準化的肺癌類器官培養方法，各個實驗室的試驗操作步驟和技術指標要求不同，造成檢測結果出現偏差。目前，《人源肺癌類器官培養技術規范》（T/SHSYCXH 12-2022）在基于《腫瘤類器官診治平臺的質量控制標準中國專家共識（2022年版）》（以下簡稱《腫瘤標準共識》）、《用于藥物篩選的人源癌癥類器官的建立方法》（以下簡稱《藥物篩選方法》）、相關標準等研究基礎上，結合此類器官的特點，反復驗證后完成制定，并已發布實施。為進一步推進、規范行業內肺癌類器官培養技術，降低由于試驗操作不同而引起的培養結果偏差，助力不同實驗室間的數據比對分析，推動肺癌類器官培養技術的發展，擴大其在醫學領域的應用范圍，本文對T/SHSYCXH 12-2022中的培養關鍵技術要求展開解析。

二、主要技術要求

T/SHSYCXH 12-2022對醫學和研究用途的肺癌類器官的培養所涉及的術語、相關設備、耗材和試劑、倫理要求、操作步驟、技術要求和檢測方法等方面進行了規范。

T/SHSYCXH 12-2022涉及的主要技術要求有肺癌類器官的原代培養條件、肺癌類器官的傳代培養條件、肺癌類器官的凍存與復蘇條件、類器官尺寸、形態學特征、病理標志物表達和基因突變等。

1.肺癌組織樣本的獲取與運輸

肺癌組織樣本的獲取與運輸要求比對見表1。

表1 肺癌組織樣本的獲取與運輸要求比對

如何在最少取樣量的同時保證試驗效果？肺癌組織樣本體積要求的確定是在研究人員對《腫瘤標準共識》和DB4403/T 122-2020（見表1）的研究基礎上，經過反復實驗驗證，最終將肺癌組織樣本的取樣量確定為＞10 mm3，為成功培養肺癌類器官的最小樣本量。

腫瘤組織樣本質量的好壞（新鮮度）直接影響類器官培養成功率的高低，故肺癌組織樣本的運輸溫度和運輸時間的確定是基于《腫瘤標準共識》中推薦的溫度與國外專家推薦的培養溫度保持一致，以保證樣本質量，降低污染風險。

2.肺癌類器官的原代培養

① 消化溫度與消化時間

該指標比對見表2。

表2 肺癌類器官的原代培養消化溫度與消化時間指標比對

肺癌類器官的原代培養消化充分，是能夠從組織中獲得足量細胞的基礎。肺癌類器官的原代培養若要消化充分，消化溫度與消化時間很關鍵。本研究的培養溫度與DB4403/T 122-2020、《藥物篩選方法》一致，且經驗證消化溫度為此時膠原蛋白酶的最快反應溫度，消化時間能夠保證組織消化充分。

② 細胞存活率

肺癌組織消化后分離獲得的細胞存活率指標，《腫瘤標準共識》要求其細胞存活率通過細胞自動計數儀檢測并且應＞90%，《人腸癌類器官》（T/CSCB 0006-2022）團體標準要求其新復蘇的類器官存活率應≥50%。經過反復的實驗驗證，肺癌類器官在消化后細胞存活率只要保持在80%以上，就可成功構建，故TSHSYCXH 12-2022要求細胞存活率指標優于T/CSCB 0006-2022，略低于《腫瘤標準共識》，即消化后的細胞存活率應＞80%。

3.肺癌類器官的傳代培養

肺癌類器官的傳代培養主要指標見表3。

表3 肺癌類器官的傳代培養指標比對

① 肺癌類器官大小

由于過早傳代會降低類器官的存活率，因此T/SHSYCXH 12-2022中傳代培養的肺癌類器官大小指標的確定是在比對《腫瘤標準共識》與T/CMCB 020-2023相關要求的基礎上，并經過驗證，確定了可以進行傳代培養的類器官平均直徑，數值更加精確，要求更高。

② 肺癌類器官的消化時間

若肺癌類器官的消化時間過短，消化會不完全；消化時間過長，則會影響細胞狀態。故T/SHSYCXH 12-2022根據DB4403/T 122-2020和《藥物篩選方法》，通過比對和反復驗證，提出了不同狀態下的該類器官的消化時間，以保證類器官狀態。

④ 肺癌類器官的傳代次數

由于不同來源的癌細胞和組織在培養過程中生長速度存在差異，因此T/SHSYCXH 12-2022在T/CSCB 0006-2022要求基礎上，對其中設定的傳代次數已進行多次試驗驗證，即首次進行傳代培養的該類器官，應能傳代兩代以上，且維持生長一個月以上可滿足試驗需求。

4.肺癌類器官的凍存與復蘇后培養

① 人源該類器官的大小

《腫瘤標準共識》要求：一般7 d內可見類器官基本形態，14 d內可見類器官明顯生長趨勢，被認為狀態佳。T/SHSYCXH 12-2022基于表3的相應要求，規定當原代培養的人源該類器官生長至平均直徑＞50 μm 時，即可進行傳代培養。

② 肺癌類器官的傳代次數

T/CSCB 0006-2022要求：從腸癌患者來源的人腸癌組織或細胞，初次在體外培養成人腸癌類器官后，應能在體外維持培養2個月，且應能傳代至少3代。由于不同來源的癌細胞和組織在培養過程中的生長速度存在差異，T/SHSYCXH 12-2022設定的傳代次數經多次試驗驗證，可滿足試驗需求，規定首次進行凍存后，復蘇培養的人源該類器官，應能傳代2代以上，且維持生長1個月以上。

5.肺癌類器官培養的檢測

肺癌類器官培養的形態檢測方法的確定是在《腫瘤標準共識》研究的基礎上，研究人員提出當肺癌類器官培養2周后的直徑＞50 μm，具有持續生長能力。該要求擴展了肺癌類器官培養成功的檢測要求，以滿足后續的傳代與試驗需求。

蘇木精-伊紅染色法常被用于觀察正常組織和病變組織的形態結構。肺癌組織表現出的核畸形，細胞質變化應在對應類器官上表現出相同形態。研究人員在經反復驗證后，肺癌類器官組織形態學特征和細胞形態學特征鑒定方法采用此染色法。

肺癌類器官病理標志物表達鑒定方法是在《腫瘤標準共識》、T/CSCB 0006-2022和反復試驗驗證的基礎上，研究人員規定了病理表達標志物，并在類器官培養后進行標志物表達鑒定和基因突變檢測，以確保類器官的成功培養。

基因突變特征鑒定方法是在T/CSCB 0006-2022的研究基礎上確定的，等同采用了該方法。

三、應用展望

T/SHSYCXH 12-2022提供了完備的類器官培養流程和鑒定方法，希望能夠有效提高肺癌類器官培養成功率，提升實驗室的培養技術，為跨批次、跨實驗室和跨平臺的技術交流提供一個完善的技術依據，助力我國引領國內外肺癌類器官培養技術，提高國際技術互認。

肺癌類器官的培養是將肺癌分離的組織在特定的3D 培養基里面進行培養，模擬體內實際的腫瘤微環境，進行一系列臨床研究。故本文希望該標準能促進生物學和疾病模型等方面的研究，肺癌類器官的培養可用于研究生物學，也可用于模擬治病過程，包括退行性疾病、傳染性和遺傳性疾病模型。

類器官是接近生理的結構，保留了來源樣本的特定功能，并能準確地再現藥物反應，故類器官培養技術填補了基于傳統細胞系的藥物篩選與臨床試驗之間的空白。T/SHSYCXH 12-2022目前已在國內一些新興生物醫藥企業得到應用，為加快肺癌臨床藥物研究和開發提供了標準支撐。

由于肺癌類器官培養采用人工操作模式，人為因素參與過多、自動化程度低，導致了系統偶然性造成的誤差較大，存在可重復性和一致性較差的情況，限制了類器官向臨床研究和商業應用轉化。本文希望該標準能有助于解決現階段肺癌類器官培養技術成本高、數據一致性和可重復性差等迫切問題，實現全流程的標準化、智能化、自動化操作，有助于推動肺癌類器官技術商業化應用。

T/SHSYCXH 12-2022提供的肺癌類器官培養流程和檢測方法，可以大大提高肺癌類器官的培養成功率，為臨床研究提供技術保障。目前，針對肺癌有效的藥物較其他癌種多，故在肺癌的耐藥機制的探究、耐藥后二線用藥的選擇方面，類器官有很大的發揮空間。同時，肺癌的可治靶點相對較多，結合類器官可以在信號通路方面進一步解讀肺癌耐藥性，大幅度提高肺癌的診療效果，推動精準醫學領域的高質量發展。