玉米籽粒皺縮突變體sh2019的分子標(biāo)記初步定位

關(guān)海英 董瑞 劉鐵山 劉春曉 何春梅 王娟 劉強 徐倩 張茂林 汪黎明

關(guān)鍵詞：玉米；籽粒皺縮突變體sh2019；分子標(biāo)記定位；表型分析；遺傳分析

玉米是集食用、飼用及多種工業(yè)用途為一體的我國第一大作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位。隨著我國人口數(shù)量的不斷增加和人們生活水平的提高，對玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的要求日益提高。籽粒是玉米營養(yǎng)物質(zhì)合成和儲藏的主要器官，其發(fā)育是決定玉米產(chǎn)量、品質(zhì)及經(jīng)濟價值的關(guān)鍵因素。挖掘控制玉米籽粒發(fā)育的關(guān)鍵基因，并解析其分子機制，對提高玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)價值具有重要的理論意義。

籽粒發(fā)育缺陷突變體是研究玉米籽粒發(fā)育的良好材料，根據(jù)表型差異，大致可以分為6種類型：籽粒嚴(yán)重缺陷突變體，等突變體；籽粒皺縮突變體，等突變體。

本研究以前期發(fā)現(xiàn)的自然突變的玉米籽粒皺縮突變體sh2019為材料，與野生型玉米自交系M017雜交組配F2代分離群體，并對其進(jìn)行表型鑒定、遺傳分析和連鎖分子標(biāo)記初步定位，以期為后續(xù)sh2019基因的克隆及功能和突變機制解析奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

籽粒皺縮突變體sh2019是本課題組從田間回交改良育種材料中發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過多代自交，其籽粒皺縮表型能夠穩(wěn)定遺傳。本試驗利用sh2019突變體與野生型玉米自交系M017進(jìn)行人工雜交，F(xiàn)1代經(jīng)自交獲得F2代，用于表型鑒定、遺傳分析和分子標(biāo)記初步定位。突變體sh2019、自交系M017及用于遺傳分析和基因初步定位的群體材料等，均種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所章丘龍山試驗基地。

1.2玉米籽粒百粒重的調(diào)查方法

從F，代成熟果穗上隨機挑選發(fā)育良好的野生型和sh2019突變籽粒，各取100粒，使用分析天平稱重，重復(fù)3次，并計算平均值。

1.3玉米籽粒出苗率的調(diào)查方法

從F，代成熟果穗上隨機挑選發(fā)育良好的野生型和sh2019突變籽粒各40粒，于2021年3月2日種在同一個培養(yǎng)盆里，放在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)10天（培養(yǎng)條件為光照16h、溫度28℃，黑暗8h、溫度25℃），以胚芽鞘露出地面為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計出苗數(shù)。設(shè)置6個重復(fù)，并計算出苗率。

1.4遺傳學(xué)分析

從F2代成熟果穗中任選3穗，對其種子進(jìn)行表型鑒定，統(tǒng)計野生型和突變籽粒的數(shù)目，用統(tǒng)計學(xué)方法計算分離比并進(jìn)行卡方檢驗。

1.5DNA提取、PCR擴增及電泳檢測

DNA提取：取純凈水浸泡48h的種子或新鮮葉片，用組織研磨儀（TissueLyserⅡ，QIAGEN）磨碎至粉末狀，取100mg利用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（DP321-03，TIANGEN）提取DNA。

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5min;95℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共34個循環(huán)；72℃延伸5min;4℃保存。

電泳檢測：配制質(zhì)量濃度為4.0%～5.0%的瓊脂糖凝膠，按體積比1：10000（Gelred：瓊脂糖凝膠）加入無毒染料Gelred，7V/cm電泳90～180min；電泳完成后，拍照保存。

1.6基因連鎖分子標(biāo)記篩選及初步定位

利用本實驗室保存的均勻分布在玉米基因組上的658對InDel和SSR標(biāo)記，對M017自交系和突變體sh2019進(jìn)行多態(tài)性分析；選取F2分離群體中各30粒sh2019突變籽粒和正常籽粒的DNA構(gòu)建混合基因池，利用BSA（bulked sample analy-sis） 篩選可能與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記，初步確定目標(biāo)基因所在位置。

2結(jié)果與分析

2.1成熟sh2019突變籽粒的表型分析

sh2019突變籽粒明顯干癟皺縮，胚乳填充不飽滿（圖1A），百粒重僅22.75 9，比野生型（40.30g）顯著降低43.55%（圖1B）；出苗率僅29.17%，顯著低于野生型（95.83%），降幅達(dá)69.56%（圖1C、D）。

2.2遺傳分析

籽粒皺縮突變體sh2019與籽粒正常的自交系M017雜交，其Fi代籽粒表現(xiàn)正常，推測籽粒皺縮性狀為隱性性狀；用得到的F2代分離群體進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)正常籽粒與皺縮籽粒的分離比符合3：1（表1）。表明突變體sh2019的籽粒皺縮表型由1對隱性核基因控制。

2.3連鎖分子標(biāo)記篩選

用本實驗室合成的658對引物借助BSA法找到1個與目標(biāo)基因連鎖的多態(tài)性分子標(biāo)記SSR74（表2），位于玉米3號染色體的長臂上。利用SSR74多態(tài)性分子標(biāo)記對F，分離群體中213個sh2019突變單株的基因型進(jìn)行檢測，結(jié)合表型分析，發(fā)現(xiàn)有4個交換單株，分別為2-2、2-4、2-14、3-12（圖2A）。

進(jìn)一步開發(fā)與sh2019基因連鎖的分子標(biāo)記，新篩選到3個多態(tài)性標(biāo)記SSR78、Chr3-11712和Chr3-12160（表2）。用這3個標(biāo)記鑒定SSR74篩選到的4個交換單株的基因型，發(fā)現(xiàn)都沒有交換單株。用這3個標(biāo)記鑒定F2分離群體中其余209個單株的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Chr3-12160有3個交換單株（2-5，3-6，3-13），標(biāo)記SSR78和Chr3-11712都沒有檢測到交換單株（圖2B、C、D）。

標(biāo)記SSR74位于靠近著絲粒的一端，檢測到的4個交換單株單倍型記為I：標(biāo)記Chr3-12160位于靠近端粒的一端，檢測到的3個交換單株單倍型記為Ⅱ；將目標(biāo)基因定位在標(biāo)記SSR74和Chr3-12160之間物理距離約為30.18Mb的片段內(nèi)（圖2E）。

3討論與結(jié)論

在玉米常規(guī)回交改良育種過程中，我們發(fā)現(xiàn)了突變體sh2019，其籽粒發(fā)育缺陷，干癟皺縮，胚乳不飽滿，百粒重和出苗率顯著降低，多代自交后該性狀能夠穩(wěn)定遺傳。本研究利用野生型玉米自交系M017與突變體sh2019組配的F1及F2群體對目標(biāo)性狀進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)籽粒皺縮表型受1對隱性核基因控制：通過集團(tuán)分離分析法篩選出4個多態(tài)性分子標(biāo)記——SSR74、SSR78、Chr3-11712和Chr3-12160，通過檢測F，分離群體中213個突變體植株的基因型，發(fā)現(xiàn)SSR74和Chr3-12160分別能檢測出4個和3個交換單株，最終將sh2019基因定位在玉米3號染色體上SSR74與Chr3-12160標(biāo)記間約30.18Mb的物理距離內(nèi)。

已報道的玉米籽粒皺縮基因shl、sh4和bt2分別定位于玉米的9號、5號和4號染色體上，而sh2定位于玉米3號染色體上，位于sh2019所在的約30.18Mb定位區(qū)間內(nèi)，sh2019與sh2是否為等位基因還需進(jìn)一步實驗確定。本研究結(jié)果可為開展sh2019基因的精細(xì)定位及相關(guān)突變機制解析和分子標(biāo)記輔助育種利用提供重要依據(jù)。