MiR-29a/b/c對葡萄膜黑色素瘤細胞功能的影響及機制

潘虹婷，王超，朱鮮，侯強

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院（生命科學(xué)學(xué)院），浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室，浙江 溫州 325027；3.瓊海市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 瓊海 571400

葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）是成人眼內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[1]，起源于眼睛中的痣細胞和黑色素細胞[2]，發(fā)生于脈絡(luò)膜（90%）、睫狀體（6%）和虹膜（4%），具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移傾向[3]。危險因素包括白色皮膚、淺色的眼睛、先天性眼部黑色素細胞增多癥、眼部黑色素痣和BAP1-腫瘤易感綜合征[4]。近年來越來越多的microRNA（miRNA）被發(fā)現(xiàn)與UM異常的信號通路有關(guān)，在細胞增殖、凋亡、血管生成、EMT和腫瘤侵襲中起著重要而又復(fù)雜的作用[5]，提示miRNA在UM致病機制中扮演著重要角色。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c[6]在白血病、乳腺癌、肝癌等癌癥中可以參與調(diào)控蛋白穩(wěn)態(tài)、代謝、增殖、細胞周期、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲、纖維化、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等多種致癌過程[7-8]。但miR-29家族在UM中的作用還不清楚。本研究將外源性的hsa-miR-29a/b/c或陰性對照（negative control, NC）轉(zhuǎn)染進UM細胞中，研究其對UM細胞增殖和侵襲能力的影響，隨后進行下游靶標(biāo)尋找，并探索其對UM功能的影響，從而初步闡明miR-29a/b/c在UM發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人UM細胞系M23和SP6.5獲贈于加拿大魁北克免疫研究中心，均分離提取自高加索患者原發(fā)性脈絡(luò)膜黑色素瘤，培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 主要藥物和試劑 DMEM培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Costar公司；Matrigel侵襲膠購自美國BD Biosciences公司；HGF購自美國R＆D Systems公司；SDS裂解液、免疫染色固定液和結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；ELISA試劑盒購自英國Abcam公司；Lipofectamine 2000、Trizol reagent購自美國Invitrogen公司；轉(zhuǎn)染所用小片段購自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 將細胞按照10%密度接種于培養(yǎng)板內(nèi)，隔天使用Lipofectamine 2000將外源性miRNA或siRNA轉(zhuǎn)入細胞。小片段對應(yīng)序列為：hsamiR-29a（5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’和5’-ACCG AUUUCAGAUGGUGCUAUU-3’），hsa-miR-29b（5’-UAGCACC AUUUGAAAUCAGUGUU-3’和5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUA UU-3’），hsa-miR-29c（5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’和5’-ACCGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’），NC（5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’和5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAT T-3’），siMMP2（5’-GGAGAGCUGCAACCUGUUU-3’和5’-ACAGGUUGCAGCUCUCCUU-3’）。

1.2.2 細胞增殖實驗 將細胞接種于96 孔板中，每孔接種1 200個細胞，接種24 h后進行分組轉(zhuǎn)染處理，組別分別為未處理的mock組、轉(zhuǎn)染陰性對照的NC組和轉(zhuǎn)染目的基因的miR-29a組、miR-29b組、miR-29c組。于轉(zhuǎn)染后的第1、2、3、4、5天進行檢測，檢測時在測定孔內(nèi)加入20 μL MTS混合液（MTS：PMS=20:1）后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使用Spectra Max M5型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）測定490 nm波長下的吸光度。

1.2.3 Matrigel Transwell實驗 在Transwell小室的上室中加入40 μL Matrigel侵襲膠，放置于培養(yǎng)箱至侵襲膠凝固。將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞消化重懸至細胞濃度為3×105個/mL，在鋪好膠的上室中加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含100 ng/mL HGF的DMEM培養(yǎng)基后放置于培養(yǎng)箱過夜。第2天取出小室，使用免疫染色固定液固定、結(jié)晶紫溶液染色、清洗、晾干，于顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并進行計數(shù)（細胞進行分組轉(zhuǎn)染，研究miR-29a/b/c 對UM細胞侵襲能力的影響時，將組別分為未處理的mock組、轉(zhuǎn)染陰性對照的NC組和轉(zhuǎn)染目的基因的miR-29a組、miR-29b組、miR-29c組；研究基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP2）對UM細胞侵襲能力的影響時，將組別分為未處理的mock組、轉(zhuǎn)染陰性對照的NC組和轉(zhuǎn)染MMP2 特異性siRNA的siMMP2組）。

1.2.4 ELISA實驗 將細胞接種于12孔板內(nèi)，隔天換成無FBS的DMEM培養(yǎng)基進行分組轉(zhuǎn)染，組別設(shè)置為轉(zhuǎn)染陰性對照的NC組和轉(zhuǎn)染目的基因的miR-29a組、miR-29b組、miR-29c組。轉(zhuǎn)染72 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液。同時使用等量SDS裂解液提取細胞總蛋白，隨后使用Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總樣本蛋白濃度以矯正細胞上清液濃度。提前取出ELISA試劑及上清液樣品于常溫復(fù)溫，每孔中加入50 μL上清液樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后使用酶標(biāo)儀測定540 nm和450 nm波長下的吸光度，計算樣品中MMP2的蛋白濃度。

1.2.5 PCR檢測 使用TRIzol reagent從轉(zhuǎn)染陰性對照的NC組和轉(zhuǎn)染目的基因的miR-29a組、miR-29b組、miR-29c組UM細胞中提取總RNA，取1 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增，將產(chǎn)物進行電泳，使用GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）拍照。引物對應(yīng)序列為：MMP2：Forward 5’-CTCAGATCCGTGG TGAGATCT-3’，Reverse 5’-CTTTGGTTCTCCAGCTTCAGG-3’；GAPDH：Forward 5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT GGT-3’，Reverse 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS25.0進行分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c抑制UM細胞的增殖能力

首先進行MTS實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c對UM細胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染2 d后，miR-29a/b/c對細胞增殖沒有明顯影響。第3天時，轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c組與對照組相比，細胞增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著時間推移，組間差異越來越明顯（P＜0.05）。這表明miR-29a/b/c均能抑制UM細胞的增殖能力。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c對M23和SP6.5增殖的影響

2.2 轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c抑制UM細胞的侵襲能力

確定miR-29a/b/c抑制UM細胞增殖能力后，我們進一步通過Matrigel Transwell實驗檢測miR-29a/b/c是否可以調(diào)節(jié)UM細胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對照對細胞侵襲沒有顯著影響，且與NC組比，miR-29a/b/c組侵襲到下室的細胞數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。這表明miR-29a/b/c可以抑制UM細胞的侵襲能力。見圖2。

圖2 Matrigel Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c對M23和SP6.5細胞侵襲能力的影響（×200）

2.3 MMP2是miR-29a/b/c直接作用的靶基因

圖3 轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c對M23和SP6.5細胞MMP2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌的影響

圖4 轉(zhuǎn)染MMP2特異性siRNA對M23和SP6.5細胞侵襲能力的影響

證實miR-29a/b/c抑制UM細胞的侵襲能力后，提取UM的總RNA進行MMP2 mRNA表達量檢測，收集UM的培養(yǎng)上清進行MMP2蛋白水平表達量的檢測，其中ELISA實驗結(jié)果使用收取上清液時的細胞全蛋白濃度進行矯正。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c后UM MMP2的mRNA沒有變化，但是miR-29a/b/c組與對照組相比，MMP2 蛋白分泌量出現(xiàn)了下降（P＜0.05）。這提示，轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c抑制UM細胞分泌MMP2，但不影響MMP2 mRNA轉(zhuǎn)錄。見圖3。

2.4 MMP2調(diào)控UM的侵襲能力

課題組前期研究[9]已證實MMP2參與調(diào)節(jié)SP6.5細胞的侵襲能力，為了進一步驗證MMP2對UM侵襲能力的影響，我們干擾M23中的MMP2后進行Matrigel Transwell實驗。結(jié)果顯示，在下調(diào)MMP2 表達后，UM的侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

UM是成人眼內(nèi)最常見的侵略性惡性腫瘤[10]，目前臨床上主要采用局部鞏膜外敷貼放射療法和眼球摘除法[11]治療。經(jīng)過治療，原發(fā)灶能夠得到有效的控制，但仍有50%的患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后存活率很低，通常在一年內(nèi)死亡[4]。到目前為止，對于UM轉(zhuǎn)移性疾病還沒有預(yù)防或治療的標(biāo)準(zhǔn)策略，UM的臨床治療仍然是個巨大的難點。

MicroRNAs是一類單鏈非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控靶基因mRNA表達[12]，于各種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，擁有作為腫瘤診斷和治療藥物的巨大潛力。其中，MiR-29家族作為眼部發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子之一[13-16]，引起了我們的關(guān)注。miR-29已在乳腺癌[17]、胃癌[18]、肝癌[19]等中被證實作為抑癌因子，在癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，而在UM中的功能鮮見報道。

為了進一步探索miR-29對UM細胞功能的影響，本研究通過加入外源性miR-29a/b/c，進行細胞功能變化檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c均能抑制UM細胞的增殖和侵襲功能，這表明miR-29家族可能參與了UM的發(fā)生和發(fā)展過程。

MMP2為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，是一種分泌型蛋白，能夠降解IV型膠原蛋白進而影響基底膜的完整性[20]并調(diào)節(jié)細胞活動[21]，有助于細胞間連接的解體和細胞外基質(zhì)的降解，從而克服細胞運動的物理限制，進而參與腫瘤侵襲活動，是抗腫瘤藥物的重要靶標(biāo)[22-23]。先前已有文獻報道MMP2在胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等中是miR-29的直接靶基因[24]，但其關(guān)系在UM中鮮有報道。為了進一步確認(rèn)MMP2與miR-29 家族在UM細胞中的關(guān)系，本研究采用了半定量PCR和ELISA實驗進行驗證。結(jié)果顯示UM細胞在轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c后，其細胞培養(yǎng)上清液中的MMP2蛋白含量明顯下降而對MMP2 mRNA的表達沒有影響。因此，我們認(rèn)為MMP2 在蛋白水平是miR-29的直接靶標(biāo)。我們之前研究發(fā)現(xiàn)干擾MMP2在SP6.5細胞系中能夠抑制細胞的侵襲功能[11]，在這里我們進一步檢測了MMP2對M23細胞侵襲功能的影響。結(jié)果顯示，在M23中，干擾MMP2同樣可以抑制細胞的侵襲能力。這些結(jié)果證明miR-29a/b/c可以通過抑制MMP2調(diào)控UM細胞的侵襲能力。

綜上，本研究在UM細胞中探索miR-29家族對細胞功能的影響，證實了miR-29a/b/c可以抑制UM細胞的增殖和侵襲功能，并證明了miR-29在UM細胞中可以通過抑制MMP2調(diào)控UM細胞的侵襲能力，這有助于進一步了解UM的疾病機制，為UM治療靶標(biāo)的尋找提供了新方向。