基于網絡藥理學探討桑白皮-夏枯草治療原發性高血壓的作用機制*

祝昕杰 張世亮 馬月香 李昱靜 玄霄宇

原發性高血壓(Essential hypertension)又稱高血壓病(HBP),其重要表現是平均血壓增加,是心腦血管疾病的危險因素,與其他危險因素并存,可損傷心、腦、腎的結構和功能,甚至導致嚴重后果及器官功能衰竭[1]。高血壓病是導致殘疾和死亡的首要危險因素,甚至比吸煙和高血糖等更嚴重[2]。降壓藥物、運動和減重等方法可達到降壓目的,但仍有部分患者血壓控制效果不盡如人意[3]。

桑白皮[4]藥用歷史悠久,可追溯到《神農本草經》。該藥味甘、性寒,歸肺經,具有瀉肺平喘、利水消腫的功效,用于醫治肺熱喘咳、顏面浮腫、小便不利等癥狀[5]。研究表明,桑白皮不僅有平喘、鎮咳、祛痰、利尿等藥效,還具有擴張毛細血管、抗炎、鎮痛、抗氧化、抗過敏、降血糖、免疫調節等諸多藥理作用[6]。夏枯草性味辛、苦、寒,有助于清肝瀉火、明目、散結消腫,可用于治療頭痛眩暈、目赤腫痛、目珠夜痛等[7]。藥理學表明,夏枯草還含有明顯降血壓、降低血糖、抗氧化、抗炎、免疫調節等功用[8]。

網絡藥理學聯通了藥物、成分、靶點,將其復雜的關系通過網絡簡單化、可視化,分析各節點的關系,進而闡釋中藥對疾病的作用機制,搭建了中醫藥與現代藥理學的橋梁,為中醫藥的研究提供了平臺[9],其系統性和整體性特征符合中醫整體觀念,從系統和網絡的角度認識了疾病與生物學的關系。本研究借助網絡藥理學,以桑白皮-夏枯草藥對為例,闡釋中醫藥治療原發性高血壓的作用機制,為進一步研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 桑白皮夏枯草潛在有效化合物的獲取與靶標的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中搜索桑白皮、夏枯草,在項目欄中,選擇類藥性(DL)≥0.18且口服生物利用度(OB)≥30%的成分,其余成分不需要經過過濾。導出篩選后的成分及其對應的所有靶標。將靶標數據導入全球蛋白質資源數據庫(UniProt,http://www.uniprot.org),翻譯成對應的人類基因簡稱,移除非人源的靶標,便于后續的分析和處理。

1.2 HBP疾病相關靶標預測訪問基因卡片數據庫(GeneCards,http://www.genecards.org),以“essential hypertension”為關鍵詞檢索,得到HBP相關靶標。

1.3 桑白皮-夏枯草與高血壓病靶標PPI網絡構建將桑白皮和夏枯草的靶標合并去除重復項,與疾病的靶標取交集,在生物分子功能注釋系統(STRING 11.5,http://string-db.org)中,限定Multiple proteins模式,勾選物種Homo sapiens,構建藥物與疾病的蛋白相互作用(PPI)網絡模型,將其輸入Cytoscape 3.9.1,利用該軟件中的Centiscape插件進行濾過,選擇介數(Betweenness)、密切度(Closeness)、連接度(Degree)作為分析條目,從而確定藥對治療HBP的核心靶標。

1.4 核心靶標的GO功能和KEGG通路富分析將上一步得到的核心靶標錄入David功能注釋網站(http://david.ncifcrf.gov),通過對“Homo sapiens”物種的生命功能和通路進行富集研究,利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)的在線繪圖技術,將富集結果可視化。

1.5 成分-靶標-通路網絡構建將藥物成分、核心靶標和前20條通路整合到Excel文件中,并將其上傳至Cytoscape 3.9.1軟件,利用軟件中的Analyze Network功能,對網絡拓撲中每個節點的參數加以解析,以確定藥物的主要藥效成分、核心靶標和關鍵路徑,最終構建出成分-靶標-通路的網絡圖。

2 結果

2.1 桑白皮-夏枯草潛在有效活性成分及靶標的獲取在TCMSP中,桑白皮和夏枯草的化學成分分別為194種和60種,經過篩選,桑白皮有效成分31種,夏枯草有效成分11種,2種藥物有3個共同成分,經過重復值刪除后,最終確定了39種有效活性成分,包括槲皮素(Quercetin)、山萘酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)等。桑白皮有6個成分無對應靶標,剩余25個成分對應195個作用靶標;夏枯草11個成分對應211個作用靶標,最終并集靶標218個。

2.2 HBP疾病相關靶標的預測在GeneCards中,發現了7964個與HBP相關的靶標。

2.3 PPI網絡構建及核心作用靶標篩選將疾病與藥物靶標進行映射,得到了194個共同靶標。使用STRING構建共同靶標的蛋白互作網絡圖,共獲得194個節點,3716條邊,平均節點度值為38.3。通過使用Cytoscape及Centiscape插件濾過得到41個核心作用靶標。其中,前5位靶標是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、細胞腫瘤抗原P53(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、人原癌基因c-Jun(JUN)。

2.4 GO功能與KEGG富集分析應用David數據平臺,對核心靶標進行分析,獲得其所參與的功能及通路。于微生信平臺繪制BP、CC、MF、KEGG氣泡圖。見圖1。

圖1 BP CC MF KEGG氣泡圖

GO分析顯示桑白皮-夏枯草治療高血壓病涉及454個生物過程,KEGG通路富集分析顯示143條通路,癌癥通路(Pathways in cancer)與高血壓病密切相關,其次是糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、膀胱癌(Bladder cancer)、脂質和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)等。

2.5 藥物成分-靶標-通路網絡構建從Cytoscape構建“中藥成分-靶標-通路”網絡圖,并從中分析選取到9個關鍵藥物成分,41個核心作用靶標,9條重要富集通路。

3 討論

高血壓病是西醫學病名,癥狀主要為頭暈、頭痛、心悸、頸項板緊、疲勞等[10],與中醫學的“眩暈、頭痛”類似[11]。《黃帝內經》曾提到:“諸風掉眩,皆屬于肝”,指眩暈屬風,為肝之變。夏枯草歸肝經,可清泄肝經郁火,治療肝火上炎或肝陽上亢的頭痛眩暈、目赤腫痛等;桑白皮清肝降壓,治療水腫脹滿尿少、肝陽肝火偏旺之高血壓病[7]。二藥合用,平肝陽,瀉肝火,消水腫,緩解眩暈[7]。

該過程涉及多種藥物成分,有研究證實槲皮素有顯著降壓效果,可作用于心血管系統,機制為抑制收縮反應、改善血管內皮依賴性松弛[12]。此外,槲皮素可以下調TLR4/NF-kB信號通路,保護實驗大鼠血管內皮功能,降低自發高血壓病大鼠的血壓值[13,14]。山萘酚有著與槲皮素相似的生化構成,在預防心血管疾病、降血糖、抗炎、抗氧化、緩解骨質疏松等方面有較高的藥用價值,臨床上已廣泛用于治療心腦血管疾病和胃癌[15]。山萘酚還可下調MAPK通路,逆轉內皮損傷及其炎癥反應[16],增強內皮依賴性血管舒張功能,其通過舒張血管,起到降壓作用[17]。研究證明,β-谷甾醇有類似于氫化可的松和強的松等較強抗炎作用,豆甾醇也有一定消炎功能,且均無可的松類藥物的不良作用,因此能夠當作輔助抗炎癥藥物持續使用,而且還具備近似于阿司匹林類的退熱鎮痛效果[18]。β-谷甾醇還具備多種藥理活性,包括抗炎、鎮痛、降低血脂和抗腫瘤等[19]。藥對中各化學成分間存在相互關系,在治療中共同發揮作用。

PPI網絡各靶標間也呈現出密切而復雜的聯系。苗艷菊等[20]研究發現AKT1 mRNA蛋白的表達與活化參與高血壓病心肌纖維化的發展。TP53是一種抑癌基因,其與細胞的增殖和惡變有關,并且可能與高血壓病左心室肥厚及動脈硬化有關[21]。TNF會使體內ET-1等縮血管物質分泌增多、NO等血管舒張因子減少,進而引發小動脈痙攣,使血壓升高[22]。王海蓉等[23]指出TNF-α、IL-6水平升高后會增加高血壓病及心血管不良事件的發生。炎癥過程中IL-6的低甲基化也與高血壓病密切相關[24]。郭光明等[25]指出C-JUN蛋白在腫瘤細胞中發揮雙向作用,促進細胞增殖和細胞凋亡雙向調節。PPI網絡錯綜復雜,也充分說明該藥對治療HBP多途徑、多靶標的復雜方式。

經過GO和KEGG分析,癌癥通路涉及關鍵靶標31個,在高血壓病治療中起到關鍵作用。AGE與RAGE相互作用,促使血管平滑肌細胞增生,進而誘導血管肥厚,產生肺動脈高壓[26]。較高的血流剪切力可以維持血管內皮的正常功能,減少內皮損傷因子的分泌,保護血管內膜,有效預防高血壓病的發生[27]。由此,中藥治療高血壓病也得到更加充分、多元的印證。

綜上所述,本研究從網絡藥理學角度初步揭示了桑白皮-夏枯草藥對治療HBP的理論,其通過多種成分、大量靶標、數種功能與信號通路協同發揮作用,這些發現為臨床治療HBP提供依據,并為進一步研究奠定基礎。但本研究是基于網絡藥理學的理論性探索,其機制仍有待進一步試驗的考察和驗證。