李文靜 潘 旭 劉 軍△ 朱 慧

痛風(fēng)是因單鈉尿酸鹽沉積于關(guān)節(jié)及周圍組織引起以反復(fù)發(fā)作炎癥為主的反應(yīng)性關(guān)節(jié)病,發(fā)病主要與嘌呤代謝紊亂、腎臟尿酸排泄障礙所引發(fā)的高尿酸血癥相關(guān),嚴重者可致關(guān)節(jié)破壞、變形[1]。目前,臨床治療痛風(fēng)的藥物主要有非甾體抗炎藥、秋水仙堿、抑制尿酸生成藥、促尿酸排泄藥等[2]。長期服用會產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、肝腎毒性等不良作用[3]。中草藥因具有成本低、安全性高、不良作用小的優(yōu)勢,已成為治療痛風(fēng)的研究熱點。

銀柴胡是寧夏道地優(yōu)勢中藥材,以根入藥,歸肝經(jīng)、胃經(jīng),具有清虛熱、除疳積、清熱涼血之功[4]。臨床常用于治療小兒疳積發(fā)熱、陰虛潮熱、感冒高熱、腹大肢瘦等疾病[5]。西醫(yī)疾病多體現(xiàn)在代謝及免疫學(xué)疾病:如痛風(fēng)、強直性脊柱炎等。痛風(fēng)屬于中醫(yī)“痹證”范疇,《本草求原》曰:“清肺、胃、脾、腎熱,兼能涼血。治五臟虛損,肌膚勞熱,骨蒸煩痛,濕痹拘攣”,但其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確[6]。因此,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討銀柴胡抗痛風(fēng)的作用機制,為臨床應(yīng)用及后續(xù)實驗驗證提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 銀柴胡活性成分收集TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫中檢索銀柴胡中的化學(xué)成分,利用口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出高度活性的有效成分。

1.2 成分作用靶點的獲取在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集銀柴胡的有效成分,PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search)[7]搜索相應(yīng)主要成分的SMILE name。將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中,預(yù)測銀柴胡有效成分對應(yīng)的潛在靶點。

1.3 痛風(fēng)相關(guān)靶點DisGenet(https://www.disgenet.org)、Genecards(https://www.genecards.org)[8]等數(shù)據(jù)庫檢索與“GOUT”相關(guān)的作用靶點,將所得靶點去除重復(fù)項后得到痛風(fēng)相關(guān)靶點。

1.4 藥物-疾病交集基因獲取分別將銀柴胡活性成分的相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點,輸入微生信(www.bioinformatics.com.cn)“2～6個數(shù)據(jù)集VENN圖”繪制交互式venn圖,篩選兩者交集基因。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)將收“藥物-疾病”共有基因?qū)隨tring平臺(Https://string-db.org/),選擇Homo spaiens,Confidences為0.7,其余參數(shù)保持默認,構(gòu)建 PPI。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型前20導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,運用“Net work analysis”功能,篩選出關(guān)鍵靶點基因,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO功能及KECC通路富集分析將共同靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行Go(Gene Ontology) 富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedida of Genes and Ge-nomes)分析,物種選擇Homo spaiens,以Pvalue<0.01,count≥5為參考值,分別篩選收集BP(生物過程)、CC(細胞過程)、MF(分子功能)條目、KEGG通路并進導(dǎo)入微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/),進行相應(yīng)GO富集氣泡圖制作及可視化分析。

1.7 成分-靶標-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選的活性化合物、靶點及 Pvalue<0.01且Count≥5主要信號通路導(dǎo)入構(gòu)建Cytoscape軟件對可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析。

1.8 分子對接依據(jù)1.4及1.6得到的主要有效成分及核心靶點進行分子對接,應(yīng)用TCMSP得到有效成分的Pubmed編號,從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.n-ih.gov/)中下載有效成分的3D結(jié)構(gòu),作為配體。從 PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.-org/)中下載靶基因的 3D 結(jié)構(gòu),作為受體;當自由結(jié)合能≤5 kJ·mol-1時,表明受體和配體對接良好,數(shù)值越小表明結(jié)合能力越好[10],Pymol 軟件自由能較低的組別進行結(jié)果制圖可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 銀柴胡活性成分及藥物靶點的篩選結(jié)果共篩選得到11個活性化合物,以Probability*>0為篩選條件,獲得265個靶基因。見表1。

表1 銀柴胡的化學(xué)成分信息(OB≥30%,DL≥0.18)

2.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點獲取以“Gout”為關(guān)鍵詞分別從 DisGenet(Score≥0.3)、Genecards(Relevance score>0.5)檢索痛風(fēng)相關(guān)靶點,去除重復(fù)值,共1128個。

2.3 藥物-疾病交集基因獲取將銀柴胡活性成分相關(guān)的265個靶點與痛風(fēng)1128個靶點進行Venn分析,得到交集基因50個。見圖1。

圖1 交集基因Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建PPI圖共涉及21個蛋白,52條相互作用關(guān)系。將前20導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析,選取 Degree、Closeness、Eigenvector和 Betweeness 都大于中位的靶點,得到8個核心靶點基因,分別為SRC、TNF、ALB、PPARA、NOS2、CASP1、PPARG。見圖2、圖3。

圖2 銀柴胡抗痛風(fēng)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 銀柴胡抗痛風(fēng)關(guān)鍵靶點基因拓撲圖

2.5 GO功能分析及 KEGG 信號通路分析按照Pvalue<0.01[9],共得到178個信號通路。以Pvalue<0.01,count≥5為參考值,篩選收集BP(生物過程)條目18個,主要包括ERK1和 ERK2級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)受體信號通路、細胞對脂多糖的反應(yīng)、肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)等;CC(細胞過程)條目16個,包括受體復(fù)合物、膜筏、核質(zhì)、質(zhì)膜、細胞質(zhì)等;MF(分子功能)條目15個,包括RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性,配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等。見圖4～圖6。KEGG通路條目11個,主要涉及癌癥的通路、化學(xué)致癌-受體活化、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、結(jié)核、PPAR信號通路等。見圖7。

圖5 GO-CC氣泡圖

圖6 GO-MF富集氣泡圖

圖7 KEGG通路富集氣泡圖

2.6 藥物-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析共10種活性化合物作用于上述11種信號通路,其中Degree值較高的為銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇等通過作用在癌癥的通路(HSA05200)、化學(xué)致癌-受體活化(HSA05207)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(HSA05417)等通路信號上的SRC、PPARG、TNF、PPARA、ALB、PRKCA等蛋白相互作用而發(fā)揮抗痛風(fēng)作用。見圖8。

圖8 藥物活性成分-靶點-疾病-通路圖

2.7 分子對接結(jié)果結(jié)合1.4及1.6得到結(jié)果,選取通路信號最多的SRC、TNF、PPARG、PPARA、ALB、PPKCA、PPARD、NOS2等關(guān)鍵靶基因分別與銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇進行分子對接,結(jié)合活性良好(-14.06～-29.46 kJ·mol-1);排名前2名的可視化圖見圖9。

圖9 銀柴胡活性成分與核心靶點分子對接構(gòu)象圖

3 討論

痛風(fēng)屬于中醫(yī)“痹證”范疇。中醫(yī)認為寒、濕等邪氣為主要病因,病位在經(jīng)脈,若走注關(guān)節(jié),痛熱甚劇。按照中醫(yī)治法,若痹證熱邪偏勝者,清熱為主[11]。現(xiàn)代研究證實,炎性細胞和細胞因子之間的相互作用與該病的發(fā)病有密切關(guān)系,當發(fā)生痛風(fēng)時,血液尿酸濃度升高,尿酸鹽結(jié)晶容易析出,對血管內(nèi)膜造成慢性炎性損害,損傷的動脈內(nèi)有大量的單核細胞黏附于內(nèi)膜上,促進IL-6、TNF等釋放[12]。本研究共篩選出銀柴胡有效活性化合物11個,拓撲圖顯示其中植物甾醇類為抗痛風(fēng)發(fā)揮主導(dǎo)作用。其中谷甾醇可通過抑制炎癥小體的核心蛋白 NLRP3 的表達,減少細胞中的促炎細胞因子生成,從而起到抗炎、抗痛風(fēng)的作用。豆甾醇顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6、MCP-1 和環(huán)氧合酶 COX-2的mRNA表達,與炎性反應(yīng)聯(lián)系密切[13]。α-菠甾醇具有抗炎和解熱的作用[14]。

本研究共預(yù)測獲得銀柴胡抗痛風(fēng)8個核心靶點,包括:SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、NOS2、CASP1、APP。SRC編碼的原癌基因酪氨酸蛋白激酶可調(diào)節(jié)細胞代謝、存活和增殖[15],能夠與PTK2B/PYK2一起在破骨細胞骨吸收中發(fā)揮重要作用,還可通過激活線粒體細胞色素C氧化酶促進破骨細胞的能量產(chǎn)生[16]。PPARG能抑制炎性細胞因子如 NF-κB、TNF-α、C反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生和活化[17]。ALB可在組織損傷或炎癥引起的白蛋白分解代謝增加,增強免疫作用[18]。NOS2能夠促進一氧化氮(NO)合成,過量的NO直接引起細胞毒副作用,對細胞造成損害,從而促進炎癥性疾病-痛風(fēng)的發(fā)生[19]。排名前10的信號通路為癌癥通路、化學(xué)致癌-受體活化、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PPAR信號通路等。其中PPAR信號通路是發(fā)揮調(diào)血脂作用的一條重要途徑,PPAR 信號通路上的蛋白如PPARA、PPRRγ 等能夠影響脂肪吸收、脂肪代謝等一系列的代謝相關(guān)重要環(huán)節(jié)[20]。PPARG通過抑制NF-KB介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)使部分組織細胞受細胞因子或炎性介質(zhì)的刺激下,表達上調(diào)[21]。TNF-α 為體內(nèi)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細胞因子,其產(chǎn)生途徑與多種蛋白產(chǎn)生的級聯(lián)效應(yīng)有關(guān)[22]。故銀柴胡抗痛風(fēng)具有多成分、多靶點、多通路的特點。

分子對接驗證銀柴胡活性成分與關(guān)鍵靶點 SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、PPARD、PRACA等之間結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇與8種蛋白均具有良好的結(jié)合活性,初步驗證銀柴胡多種有效成分通過作用于關(guān)鍵靶點起到抗痛風(fēng)的作用,為后續(xù)進一步實驗驗證及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。