玉米秸稈降解復合菌系的篩選及發酵產短鏈脂肪酸

汪文君 劉國慶 王志花

汪文君，劉國慶，王志花. 玉米秸稈降解復合菌系的篩選及發酵產短鏈脂肪酸［J］. 湖北農業科學，2024，63（2）：55-58．

摘要：利用篩選得到的復合菌系來發酵玉米秸稈，研究復合菌系對降解秸稈產短鏈脂肪酸的影響，并對微生物菌群結構組成進行解析。結果表明，復合菌系在前4 d的降解速度最快，秸稈、纖維素和木質素的降解率分別達30.35%、27.07%和14.71%，在12 d時，其降解率分別達40.02%、32.25%和20.93%。復合菌系的代謝產物以異丁酸和乙酸為主，其含量分別占總短鏈脂肪酸的36.46%和33.15%。由高通量測序可知，復合菌系中的優勢菌屬主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等組成。

關鍵詞：玉米秸稈； 復合菌； 篩選； 降解； 短鏈脂肪酸

中圖分類號：Q939.9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）02-0055-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.02.010 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening of maize stover degradation complex strains and fermentation to produce short-chain fatty acids

WANG Wen-jun， LIU Guo-qing， WANG Zhi-hua

（School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei? 230601，China）

Abstract： The compound strains obtained by screening were used to ferment corn straw， the effects of the compound strains on degrading straw to produce short-chain fatty acids were studied， and the structural composition of the microbial consortium was analyzed. The results showed that the degradation rate of the compound strain was the fastest in the first 4 days. The degradation rates of straw， cellulose and lignin reached 30.35%， 27.07% and 14.71%， respectively. At 12 days， the degradation rates reached 40.02%， 32.25% and 20.93%， respectively. The metabolites of the compound strain were isobutyric acid and acetic acid， which accounted for 36.46% and 33.15% of the total short chain fatty acids， respectively. According to high-throughput sequencing， the dominant bacteria genera in the compound strains were mainly composed of Clostridium sensu stricto， Cellulosilyticum， Clostridium XIVa， Enterobacteriaceae and Peptostreptococcaceae.

Key words： corn straw； compound bacteria； screening； degradation； short chain fatty acids

中國是農業生產大國，農作物秸稈種類繁多，占國內生物質資源總量的50%以上^［1］。以水稻、小麥和玉米秸稈為主，其中，36.7%為玉米秸稈，在所有秸稈中占最大部分，這可能與中國大部分地區主要農作物是玉米相關^［2］。纖維素、半纖維素以及木質素含有極為豐富的碳元素、較低的氧含量，故其能量密度較高，是玉米秸稈的主要組成成分，若能將其合理并高效利用，將是一種極好的生物能源^［3］。因此如何提高秸稈的綜合利用率成為全社會關注的熱點問題。

厭氧發酵是秸稈等農業廢棄物高值化利用的有效技術手段，該方法的實質是厭氧微生物將有機廢棄物降解為低分子量化合物，在發酵過程中獲得沼氣等可燃性能源氣體以及富含有效營養物質和穩定腐殖質的產品^［4，5］。但秸稈產沼氣工藝存在降解率低、降解周期長及成本投資高等缺陷^［6-8］。而秸稈厭氧發酵產短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）工藝，因其發酵周期短、經濟效益高等顯著優勢成為極具前景的新型高值化利用方向^［9］。SCFAs是一種由6個或6個以下碳原子組成的短鏈單羧酸。常見的SCFAs有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和丁酸乙酯等^［10］。在厭氧發酵過程中，添加甲烷菌抑制劑可使得產甲烷菌停止作用，SCFAs則無法被轉換為甲烷，從而可獲得高濃度的SCFAs^［11］。這些酸具有廣泛的應用，如生產醇、醚等化工原料，替代不可再生的化石資源^［12］。此外，有研究報道SCFAs在維持人類健康方面具有非常特定的功能，影響各種疾病的發展、預防和治療^［13］。

本研究從污泥中篩選得到能高效降解玉米秸稈的復合菌系，通過高通量測序，明確該復合菌系的優勢菌屬組成，同時對其發酵產物即短鏈脂肪酸進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈取自安徽省阜陽市農場，烘干粉碎后過30目篩網，密封常溫保存。

復合菌系是由合肥工業大學食品與生物工程學院實驗室從污泥中篩選得到。

1.2 方法

1.2.1 培養基

1）富集培養基：氯化銨1 g/L、磷酸氫二鉀0.4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、氯化鎂1 g/L、酵母膏1 g/L，指示劑為刃天青和L-半胱氨酸，培養基的pH為7.0～7.2。

2）厭氧產酸菌培養基：氯化銨1 g/L、氯化鎂1 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、酵母膏1 g/L、氯化鈉1 g/L、葡萄糖8 g/L，溴甲酚紫指示劑5 mL，指示劑為刃天青和L-半胱氨酸（培養基的pH為7.0～7.2）。

3）發酵培養基：氯化鈉5 g/L、氯化銨1 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏提取物1 g/L、碳酸鈣2 g/L。

1.2.2 富集 厭氧瓶預先分裝0.5%（m/V）濾紙條，通氮氣排空厭氧瓶的氧氣。預加900 mL去離子水于1 L的三角瓶中，稱取富集培養基組分并依次溶解，調pH至7左右，補去離子水至1 L并加熱煮沸，直到刃天青的顏色消失，再接著煮沸5 min，最后分裝到厭氧瓶中，121 ℃高溫滅菌30 min，每個厭氧瓶中分裝50 mL培養基，接種量為10%，35 ℃靜置培養。待濾紙開始降解時，轉接到新鮮的培養基中繼續富集，將連續富集3次之后的培養物用于進一步篩選。

1.2.3 復合菌系的篩選 參考張鑫等^［14］的研究方法，篩選能夠降解玉米秸稈的復合菌系。在50 mL培養基中接種富集培養液，并加入5 g秸稈作為碳源，瓶內放入1片濾紙條作為分解的外觀指標，35 ℃靜置培養。當瓶內濾紙條降解，秸稈發生軟化時取2.5 mL培養液作為種子接種到同樣的新鮮培養基中。如此轉接數代，逐漸淘汰分解速率慢的培養物，留下具有較強分解能力的培養物繼續培養。等留下的培養物到10代以上仍然具有較好的分解能力時，選擇具有高分解能力的培養物，進行發酵試驗。

1.3 試驗設計

稱取30 g玉米秸稈，置于1%氫氧化鈉溶液中浸泡24 h，之后用去離子水對秸稈反復沖洗直至pH接近中性，然后置于80 ℃的鼓風干燥箱中進行干燥以用于厭氧產酸發酵，發酵周期為12 d。為抑制甲烷的產生，在發酵起始階段添加一定的碘仿乙醇溶液作為甲烷抑制劑。

1.4 指標測定

采用濾網過濾產酸發酵液測定玉米秸稈降解率，將殘留物于85 ℃烘干并稱質量，用減質量法計算出秸稈降解率^［15］，采用比色法^［16］測定纖維素降解率，采用普魯士法^［17］測定木質素的降解率。采用pH計（PHS-3C型）測定pH，短鏈脂肪酸采用GC-MS（QP2010 Plus型）測定。秸稈降解率、pH和短鏈脂肪酸每2 d測定1次。

1.5 微生物多樣性的測定

為探究復合菌系微生物組成，分析降解木質纖維素的微生物，采用高通量測序方法進行微生物多樣性的測定。取3個平行樣品，將樣品以13 000 r/min離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物按照試劑盒（OMEGA E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒）說明書進行DNA提取。將檢測合格的DNA樣品采用16S V3-V4引物進行第一輪PCR擴增。PCR反應體系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、ddH2O 9～12 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，預循環5次；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環20次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪PCR擴增。第二輪PCR反應體系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、ddH2O 9～12 μL。第二輪PCR反應條件：95 ℃變性3 min；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環5次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈發酵中降解率的變化

由圖1可以看出，秸稈降解率的變化趨勢與潘云霞等^［18］利用復合菌系預處理稻稈的降解趨勢具有一致之處。前4 d秸稈的降解速度最快，在4 d時，秸稈的降解率達30.35%，纖維素和木質素的降解率分別達27.07%和14.71%，較青格爾等^［19］篩選的復合菌系GF-20在玉米秸稈達到相似降解率時的時間縮短了11 d。6 d后，秸稈的降解率逐漸增加緩慢，其原因可能與代謝產物的抑制、底物的減少等因素有關^［20］。培養至12 d時，秸稈的降解率達40.02%，纖維素和木質素的降解率也分別達32.25%和20.93%，這表明該復合菌系在降解玉米秸稈方面具有較大潛力。

2.2 發酵體系內pH的變化

由圖2可知，pH在前6 d由7.1迅速降至5.0隨后又緩慢降至4.5，這可能是因為SCFAs生成速率的變化。之后由于SCFAs含量的降低和蛋白質的分解^［18］，使得pH在8 d后稍有增加，在12 d時達4.9左右，此變化趨勢符合細菌復合菌群分解木質纖維素的特殊規律，是正常分解能力的體現，如果pH不能回升則證明復合菌群已經失去分解效果^［21］。這也意味著該復合菌系具有一定的pH調節能力。

2.3 短鏈脂肪酸的產生

發酵過程中短鏈脂肪酸的濃度變化如圖3所示。由圖3可以看出，復合菌發酵產酸過程中，乙酸在2 d時就處于較高濃度，達1.65 μg/mL，隨后乙酸含量迅速下降，在6 d時降到0.75 μg/mL，之后基本保持恒定。丁酸濃度的變化趨勢與乙酸相似。在整個發酵過程中，丙酸的濃度都較低，而且變化不大。復合菌處理秸稈12 d，異丁酸含量占總SCFAs的36.46%，乙酸含量占總SCFAs的33.15%，而丙酸和丁酸在整個秸稈發酵階段都保持較低的含量，僅分別占SCFAs的10.65%和19.74%。這說明復合菌系發酵秸稈是以乙酸和異丁酸為主的丁酸型發酵。

2.4 復合菌系的物種組成

基于樣品OTUs聚類分析，該復合菌系在門分類水平和屬分類水平上的微生物相對豐度如圖4所示。3個平行樣品在門分類水平上細菌種類相對較少，主要含有厚壁菌門（Firmicute）和變形菌門（Proteobacteria），兩者總相對豐度占98%以上。其在屬分類水平上物種組成結構類似，但菌群相對豐度略有差異，可以看出優勢菌屬主要為Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等。

3 小結

1）本試驗篩選的復合菌系降解玉米秸稈過程中，在前4 d的降解速度最快，秸稈、纖維素和木質素的降解率分別達30.35%、27.07%和14.71%，在12 d時，其降解率分別達40.02%、32.25%和20.93%。這表明篩選的復合菌系在降解木質纖維素方面有一定的效果。

2）復合菌系的代謝產物以異丁酸和乙酸為主，其含量分別占總短鏈脂肪酸的36.46%和33.15%，其中乙酸的最高含量達1.65 μg/mL。

3）該復合菌系主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等優勢菌屬組成。

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收稿日期：2022-11-22

基金項目：安徽省省級重點基金項目（JZ2022QSKJ0010）

作者簡介：汪文君（1998-），女，安徽黃山人，在讀碩士研究生，研究方向為食品質量與安全，（電話）15256595484（電子信箱）980370781@qq.com；通信作者，劉國慶（1963-），男，教授，主要從事生物質資源高值化利用的研究，（電子信箱）13675512000@163.com。