沉默TUFM通過AMPK/mTOR信號通路調控線粒體自噬對肺源性心臟病模型大鼠肺動脈高壓的影響

崔本科,王巖,盧云鳳,杜鵑,翟羽涵

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種惡性心血管疾病,以肺血管床阻塞性重構和進行性阻力增加為特征,最終導致右心功能障礙[1]。目前針對PAH發病機制的研究主要集中在肺血管平滑肌細胞,但由于其調控通路中信號分子的復雜性,其機制仍不清楚。最近的研究證實,線粒體通過感知缺氧、氧化應激和凋亡在PAH發病中發揮重要作用[2],提示線粒體代謝可能是PAH的關鍵調節因素。線粒體自噬作為線粒體質量控制的必要手段,可選擇性地清除受損線粒體碎片,防止線粒體和細胞功能障礙[3]。報道稱線粒體自噬的激活導致肺動脈平滑肌細胞過度增殖,增加肺血管阻力[4],但其調控PAH的確切分子機制尚未可知。線粒體翻譯延伸因子Tu(mitochondrial translation elongation factor Tu,TUFM)部分位于線粒體外膜上,與蛋白質翻譯延伸合成、氧化磷酸化和蛋白質控有關[5]。其表達異?？赏ㄟ^引起線粒體呼吸鏈失衡和/或促進電子泄露,導致活性氧產生,影響細胞穩態[6]。最近的PAH模型大鼠線粒體蛋白質組分析鑒定了TUFM的差異表達[7],但關于TUFM在PAH進展中的生物學作用知之甚少。因此,本研究旨在揭示TUFM對PAH發生發展的影響,并探討其可能的調控機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

1.1.1 實驗動物:36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,4～5周齡),由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2021-0004。所有大鼠均飼養于遼寧省人民醫院動物實驗中心,標準飼養條件,自由飲食,適應1周后進行實驗。

1.1.2 試劑耗材:大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMC)購自北京中科質檢生物技術有限公司;野百合堿(MCT,貨號C2401,美國Sigma-Aldrich);蛋白定量檢測試劑盒(貨號:14G30C40,武漢博士德公司);蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(貨號:G1120,北京索萊寶公司);TUFM、CD31、Bcl2相關X蛋白(Bax)抗體(貨號:ab173300、ab222783、ab182734,美國Abcam公司);α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(貨號:BM0002,美國BOSTER公司);人微管相關蛋白輕鏈3(LC3)、芐氯素1重組蛋白(BECN1)、P62、凋亡酶激活因子(Apaf)、β肌動蛋白(β-actin)抗體(貨號:3868、3495、39749、8723、4970,美國CST公司);B淋巴細胞瘤2(Bcl2)抗體(貨號:ET1702-53,美國HUABIO公司);磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化(p)-AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR抗體(貨號:bs-5551R、bs-2771R、bs3494R、bs3495R);細胞計數(CCK-8)檢測試劑盒(貨號:HY-K0301,美國MCE公司)。

1.1.3 主要實驗儀器:脈沖多普勒儀(Vevo 2100,Visualsonics公司);透射電子顯微鏡(HT 7700,日本HITACHI公司);Cytation3多功能酶標儀(美國BioTek公司);Chemi Doc XRS化學發光凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司);160HR高速冷凍離心機(美國賽默飛公司);倒置式生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法 2022年1月—2023年6月于遼寧省人民醫院中心實驗室進行實驗。

1.2.1 PAH實驗動物模型構建及分組:將36只大鼠隨機分成6組:空白對照(Ctrl)組,模型(PAH)組,TUFM過表達(OE)組,OE陰性對照(OE-NC)組,短發夾RNA(Sh)敲除TUFM(Sh)組和Sh陰性對照(Sh-NC)組,每組6只。Ctrl組僅給予等量生理鹽水,其余5組根據文獻[8],將溶解于0.5 mmol/L鹽酸(pH=7.4)溶液的1% MCT(60 mg/kg)一次性腹腔注射誘導肺源性心臟病大鼠模型?；诿绹鴩疑锛夹g信息中心相關序列(NM_001106295.1),選擇具有平滑肌22α(SM22a)基因的血清型腺相關病毒(AAV9)作為平滑肌特異性啟動子。對于OE和Sh組,在給予MCT的同時將1 ml含有1012GC/ml滴度的敲低或過表達的AAV9分別注射到大鼠尾靜脈中,OE-NC組和Sh-NC組使用等體積的相應空溶劑作為陰性對照,4周后進行后續實驗。序列如下:Sh-TUFM:上游,5′-CCCUGGUCAUGCAGAUUAUTT-3′和下游,5′-AUAAUCUGCAUGACCAGGGTT-3′和Sh-NC:上游,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游,5′-ACGUGACACGU-UCGGAGAATT-3′。

1.2.2 細胞模型制備及分組處理:PASMC聚集至80%～90%時,更換為無血清改良Eagle培養基,置于37℃培養箱內饑餓處理24 h,更換常規培養基,隨機分為常氧(Norm)組、低氧(Hyp)組、小干擾RNA(SiRNA)-1組、SiRNA-2組、Si-NC組、OE-NC組和OE組。Norm組和Hyp組分別置于常氧(21%O2, 5%CO2,74%N2,37℃)和低氧(3%O2,5%CO2,92%N2,37℃)培養箱中培養24 h;Si-NC組、SiRNA-1組、SiRNA-2組、OE-NC組和OE組細胞分別轉染攜帶Si-NC、Si-TUFM-1組、Si-TUFM-2、OE-NC和OE-TUFM質粒,孵育6 h后,放入低氧培養箱中培養24 h。序列如下,Si-TUFM-1:上游,5′-CACCGAGUUUGGCUAUAAATT-3′和下游,5′-UUUAUAGCCAAACUCGGUGTT-3′; Si-TUFM-2:上游,5′-GGGCUAAGUUCAAGAAGUATT-3′和下游,5′-UACUUCUUGAACUUAGCCCTT-3′; Si-NC:上游,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3 血流動力學測定和組織收集:各組大鼠使用2.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉并固定在工作臺上。脈沖多普勒檢測肺動脈多普勒信號,并測量肺動脈加速時間(PAAT)。每次測量重復3次,計算平均值。使用頸靜脈右心導管插管直接檢測血流動力學數據:經頸行正中切口,鈍性分離右頸外靜脈,將3F聚乙烯導管插入主肺動脈,參照文獻[9]方法測量肺動脈壓力。用生理鹽水沖洗右肺和右心組織以清除血液,液氮冷凍,-80℃保存。左肺用4%多聚甲醛固定,石蠟切片行組織學檢查。

1.2.4 大鼠肺小動脈形態學檢測:根據HE染色試劑盒說明書,石蠟切片行HE染色,光學顯微鏡下觀察肺內小動脈病理情況。在低倍視野下隨機選取外徑(ED)50～200 μm的血管,分析血管內徑肥大情況。測量ED和中膜厚度(MT),并按照文獻[10]根據MT百分比(MT%=2×MT/ED×100%)計算動脈重塑。

1.2.5 免疫熒光共染色檢測TUFM定位:石蠟切片用過氧化氫處理后,5%牛血清白蛋白封閉,然后分別與TUFM、α-SMA或CD 31單克隆抗體在4°C下孵育過夜。洗滌未結合的一抗后,滴加異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠IgG、Cy3標記的羊抗兔IgG二抗在37°C下孵育30 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木精復染并封片,熒光顯微鏡下觀察拍照記錄。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測TUFM、自噬、凋亡和AMPK/mTOR相關蛋白表達:將收集的肺組織和PASMC細胞加入含有苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液,冰上裂解30 min。二喹啉甲酸法測定蛋白濃度,等量的蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜后將聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂牛奶封閉2 h,分別加入TUFM、LC3、BECN1、P62、Bax、Bcl2、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR(抗體稀釋倍數1∶1 000)和β-actin(1∶10 000),4℃孵育過夜。次日,將膜與含有辣根過氧化物酶的二抗在室溫下孵育1 h。洗滌后,使用增強化學發光法對條帶顯影,以β-actin作為內參,Image J軟件進行灰度值測定分析。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞增殖活力:根據說明書使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。用上述不同條件處理細胞,然后胰蛋白酶消化并均勻接種到96孔板中。每孔加入100 μl CCK-8混合液,37°C下孵育2 h。分別在12、24和36 h利用酶標儀測量450 nm處吸光度。

1.2.8 透射電鏡檢測細胞線粒體結構:將PASMC細胞按照上述方式處理24 h后,戊二醛固定,用PBS洗滌3次。然后用1%鋨酸處理,再次用PBS沖洗,并用丙醇脫水。將細胞包埋在環氧樹脂和2%醋酸鈾-飽和乙醇溶液中。通過透射電子顯微鏡觀察不同處理組的線粒體結構和自噬小體。

2 結 果

2.1 PAH模型大鼠肺動脈TUFM表達水平及定位 Western blot結果顯示,與Ctrl組比較,PAH組大鼠肺動脈TUFM蛋白表達顯著升高(P<0.05,圖1A、B)。熒光共染結果顯示,綠色熒光標記的TUFM與紅色熒光標記的PASMC標志物α-SMA在肺小動脈內膜重合為黃色熒光,存在共定位;而TUFM與內皮細胞標志物CD31未見明顯重合和共定位(圖1C)。

注:A.Western blot檢測PAH大鼠肺動脈TUFM蛋白表達;B.灰度值統計圖;C.免疫熒光檢測TUFM定位(×200)。Marker.目的蛋白;TUFM.線粒體翻譯延伸因子TU;DAPI.4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚;Merge.合并。與Ctrl組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.2 TUFM對PAH大鼠血流動力學的影響 與Ctrl組比較,PAH組肺動脈收縮壓(PASP)升高,PAAT縮短(P<0.05);與PAH組比較,OE組PASP顯著升高,PAAT明顯縮短(P<0.01);與PAH組比較,Sh組PASP降低,PAAT延長(P<0.05),見圖2。

注:A. 頸靜脈右心導管插管檢測PASP;B.脈沖多普勒超聲檢測PAAT。與Ctrl組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PAH組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.3 TUFM對PAH大鼠肺動脈重構的影響 HE染色結果顯示,與Ctrl組比較,PAH組大鼠遠端肺小動脈管壁呈向心性增厚,管腔狹窄幾乎堵塞,MT百分比顯著升高(P<0.05);與PAH組比較,Sh組肺小動脈管壁厚度和管腔狹窄度有所改善;OE組肺小動脈管壁厚度明顯高于PAH組(P<0.05),見圖3。

注:與Ctrl組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PAH組比較,#P<0.05。

2.4 TUFM對PAH大鼠線粒體自噬和細胞凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示,與Ctrl組比較,PAH組大鼠肺動脈TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2蛋白表達升高,P62、Bax和Apaf蛋白表達降低(P<0.05);與PAH組比較,OE組肺動脈TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表達顯著升高,P62、Bax和Apaf表達明顯降低(P<0.05),Sh組TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表達降低,P62、Bax和Apaf表達升高(P<0.01),見圖4。

注:與Ctrl組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PAH組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.5 缺氧對PASMC細胞TUFM蛋白表達的影響 與Norm組比較,Hyp組細胞缺氧刺激可上調TUFM表達(P<0.01),見圖5。

注:**P<0.01。

2.6 缺氧對PASMC細胞線粒體自噬和凋亡相關蛋白表達的影響 與Si-NC組比較,SiRNA-1和SiRNA-2組細胞P62和Bax蛋白表達升高,BECN1、LC3II/I、Bcl2和TUFM表達降低(P<0.05);與OE-NC組比較,OE組細胞P62和Bax蛋白表達降低,BECN1、LC3II/I、Bcl2和TUFM表達升高(P<0.05),見圖6。

2.7 缺氧對PASMC細胞線粒體結構的影響 透射電鏡發現,Si-NC組和OE-NC組在缺氧條件下線粒體輕微腫脹,但膜仍完整;部分損傷的線粒體嵴減少,損傷線粒體包裹在自噬體中。SiRNA-1和SiRNA-2組細胞線粒體結構完整,嵴存在,膜完整,僅有少量自噬溶酶體。OE組可見部分線粒體損傷崩解,嵴斷裂消失,以及一些含有受損線粒體片段的自噬小體,見圖7。

圖7 透射電鏡檢測缺氧對PASMC細胞線粒體結構的影響(×8 000,箭頭代表自噬小體)

2.8 TUFM對缺氧誘導PASMC細胞增殖活性的影響 CCK-8法檢測結果顯示，與Si-NC組比較,SiRNA-1和SiRNA-2組細胞增殖活性顯著降低(P<0.05);與OE-NC組比較,OE組細胞增殖活性明顯升高(P<0.01),見圖8。

注:與Si-NC組比較,*P<0.05,**P<0.01;與OE-NC組比較,#P<0.05。

2.9 TUFM對缺氧誘導PASMC細胞AMPK/mTOR通路相關蛋白表達的影響 與Si-NC組比較,SiRNA-1和SiRNA-2組細胞p-AMPK表達降低,p-mTOR表達升高(P<0.05);與OE-NC組比較,OE組細胞p-AMPK表達升高,p-mTOR表達降低(P<0.05),見圖9。

注:*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

PAH是一種進行性致死疾病,以肺小動脈重塑導致肺動脈阻力增加為特征,最終發展為右心功能障礙或右心衰竭。PAH發病機制復雜,涉及遺傳、缺氧、氧化應激、糖代謝失衡等多方面因素,其病理主要包括PASMC過度增殖和/或抑制凋亡以及膠原和彈性蛋白等細胞外基質的積累。但由于其分子機制不完全清楚,臨床缺乏有效治療藥物,預后仍然較差。因此,迫切需要探索能有效抑制PASMC增殖并改善肺動脈重塑的靶向藥物和內在機制。

線粒體作為細胞穩態的中心監護者,協調多種細胞生物過程,如細胞周期進程、線粒體動力學和細胞代謝等,與PAH的發病機制和病理過程密切相關[11]。TUFM是線粒體DNA翻譯表達的重要因子,在線粒體功能調控中起關鍵作用。既往研究顯示,TUFM可控制線粒體DNA編碼肽的氨基酸延伸,并且其水平的變化能夠影響多種細胞生物活性[6, 12-13]。最近的PAH肺動脈蛋白質組學研究發現,PAH與正常個體之間存在TUFM差異表達[7]。因此,結合PAH的發病機制以及TUFM與線粒體功能的關系,推測TUFM可能參與PAH的發生發展。本研究在MCT誘導PAH大鼠模型中發現,與空白對照組相比,PAH大鼠和細胞模型中TUFM表達明顯增加,且主要定位于肺小動脈中膜平滑肌細胞,而不聚集于內層內皮細胞,與PAH主要病變細胞相一致[14]，這提示低氧誘導的PAH發生發展過程中TUFM可能起到一定程度的作用,但其中機制尚不明確。

為了探索TUFM是否參與PAH的發展及其在病理過程中的作用,本研究引入TUFM敲低或過表達質粒的AAV9腺相關病毒,構建MCT處理的TUFM沉默或過表達大鼠模型。4周后,TUFM的缺失抑制了PAH的發展,改善PAH小鼠血流動力學情況和肺小動脈血管重構,而過表達TUFM則加重PAH病理結構損傷。此外,與自噬呈負相關的自噬底物P62在Sh組中的表達水平高于PAH組,表明在無TUFM的情況下肺動脈線粒體自噬減少。自噬產物LC3II/I和BECN1水平降低也顯示了Sh組線粒體自噬減少。據報道,PAH的發生與PASMC的自噬激活、過度增殖和凋亡抵抗密切相關[14],存在自噬/凋亡互反饋調節機制,逆轉自噬/凋亡失衡可有效改善血管重構,從而降低肺動脈壓。研究發現,BECN1/Bcl-2在調控自噬/凋亡平衡中發揮關鍵調控作用[15]。另外,本研究發現TUFM沉默促進PASMC細胞增殖的同時,引起抗凋亡基因Bcl-2表達下調,而凋亡促進因子Bax和Apaf表達上調,反之亦然。因此,TUFM的缺失減輕了體內PAH的發展,這可能歸因于線粒體自噬和凋亡調節。

為了探討TUFM基因沉默抑制線粒體自噬和增殖/凋亡的分子機制,筆者重點研究了已知的信號分子AMPK和mTOR來闡明可能的途徑。據報道,AMPK和mTOR通過調控自噬激活激酶1(ULK1)調節自噬,Lin等[16]報道,雙酚A可通過激活AMPK/mTOR/ULK1信號通路激活促進卵巢顆粒細胞自噬。Gui等[17]發現,紅景天苷通過AMPK/mTOR/ULK1通路上調細胞自噬,減輕低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡抵抗。本研究結果發現,AMPK和mTOR的總蛋白水平不受TUFM水平的影響,但p-AMPK和p-mTOR的磷酸化激活受TUFM表達的調節。這說明AMPK和mTOR的活性在一定程度上受TUFM調控。此外,線粒體自噬標志物P62、BECN1和LC3II/I均受TUFM和p-AMPK/p-mTOR的調節。既往研究提示,AMPK通過磷酸化其Ser-555和Ser-777位點來刺激ULK1,而mTOR通過磷酸化ULK1中的不同Ser殘基(Ser-757)來抑制自噬[18]。而且mTOR抑制劑和/或AMPK激活劑預處理內質網應激可擴大自噬的“生存窗口”。 這些研究表明,AMPK/mTOR通路在線粒體自噬中起樞紐作用,并調節線粒體功能和穩態。最近有學者提出,AMPK/mTOR誘導的線粒體自噬增強通過控制一些蛋白的濃縮和溶解來調節編碼關鍵線粒體蛋白的核mRNA[19]。而且,TUFM是AMPK和mTOR的上游分子,這一點通過敲低或過表達的狀態得到證實。這些結果提示,TUFM通過參與線粒體蛋白的合成,影響線粒體功能和穩態,進而調節整個細胞的功能。

本研究也存在一些局限性,首先,盡管缺氧可以部分模擬PAH的體內環境,但它并不完全代表MCT誘導PAH的發病機制,TUFM研究需要一種模擬PAH的良好體外刺激。其次,遺憾的是沒有使用AMPK或mTOR的干擾劑來進一步證實信號通路。鑒于線粒體功能調控在細胞周期過程中的重要性和復雜性,下一步的研究將從線粒體的功能和代謝調控兩個方面來探討PAH的發生機制。

綜上所述,抑制TUFM可通過激活AMPK/mTOR信號通路抑制PAH肺動脈平滑肌細胞線粒體自噬,改善PASMC在缺氧條件下的增殖/凋亡失衡,這說明PAH肺動脈平滑肌細胞過度增殖至少部分是由于TUFM被激活促進線粒體自噬而導致的,這為改善PAH肺動脈重塑提供了新的靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

崔本科:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;王巖:提出研究思路,分析實驗數據,論文審核;盧云鳳:實施研究過程,資料搜集整理;杜鵑:進行統計學分析;翟羽涵:論文修改