血清骨鈣素及SIRT6在急性缺血性腦卒中的表達及預后價值分析

何德英,潘成德,郭富饒,江思德

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是腦卒中最常見類型,近年來其患病率呈逐漸升高的趨勢[1]。AIS一旦發生,病情急劇發展,伴隨較高的致殘率和致死率[2]。尋找能評估AIS病情及預后的生物標志物,對于改善患者預后具有重要意義[3]。骨鈣素是由BGLAP基因編碼,由非增殖期成骨細胞特異性合成和分泌,參與骨形成、葡萄糖及脂肪代謝的調節[4]。近年來發現,血清骨鈣素等骨代謝指標表達失常可增加腦卒中發生的風險,是潛在的AIS血清標志物[5]。去乙酰化酶6(sirtuin 6, SIRT6)具有組蛋白賴氨酸殘基的脫乙酰酶作用,參與氧化應激、炎性反應、自噬及衰老等多種生物學過程[6]。研究發現,在急性腦缺血小鼠模型中,SIRT6表達下調能夠促進神經細胞凋亡,增加動物病死率,是潛在的AIS血清標志物[7]。本研究通過檢測AIS患者血清骨鈣素、SIRT6表達,探討兩者對AIS患者臨床預后的預測價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019年2月—2021年2月重慶市巴南區人民醫院神經內科診治AIS患者90例為AIS組,男44例,女46例,年齡31～83 (64.35±7.34)歲;體質量指數(BMI)19～27 (22.52 ±2.28) kg/m2,病程1～24(6.12±2.13)h;吸煙史33例,飲酒史40例;既往史:高血壓46例,糖尿病18例;頭顱MR測量梗死面積:≤4 cm260例、>4 cm230例。以同期診治的高血壓或糖尿病患者90例為非AIS組,男48例,女42例,年齡31～78 (62.97±7.81)歲;BMI 18～29(22.53±2.41) kg/m2;高血壓60例,糖尿病30例;吸煙史30例,飲酒史38例。以同期體檢健康者90例為健康對照組,男45例,女45例,年齡32～80 (63.82±8.01)歲;BMI 18～28 (22.49 ±2.31) kg/m2。3組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史及飲酒史比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(KY20198134075009),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①根據患者臨床表現、頭顱MR明確診斷為AIS,同時診斷和治療原則均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中的相關標準[8];②初次發病;③患者發病到入院時間小于24 h;④無意識障礙及抽搐史;⑤臨床資料完整。(2)排除標準: ①既往有AIS病史;②入院予以靜脈溶栓、血管內治療者;③合并顱腦腫瘤、顱腦外傷、嚴重心律失常、心肌梗死等;④合并骨質疏松、強直性脊柱炎等疾病。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 臨床資料收集:包括性別、年齡、BMI、高血壓、糖尿病等資料;檢測血脂(總膽固醇、三酰甘油、高密度和低密度脂蛋白膽固醇)水平;頭顱MR檢查并計算腦梗死面積。AIS患者入院時進行美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)評分[9],評分范圍0～42分,評分越高,神經功能缺損程度越重。根據NIHSS評分,分為輕癥亞組(0～15分,30例),中癥亞組(16～30分,33例)和重癥亞組(31～42分,27例)。

1.3.2 血清骨鈣素、SIRT6測定:于患者入院次日清晨和健康對照組體檢時采取肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h,離心留取上層血清。以ELx800型酶標儀(Biotek公司)檢測血清骨鈣素(酶聯免疫吸附試劑盒購自上海撫生生物公司,貨號A102876)、SIRT6水平(酶聯免疫吸附試劑盒購自上海滬震生物科技公司,貨號HZ-2117)。

1.3.3 隨訪:患者出院第3個月時均接受門診復查,應用改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRS)評估其預后情況并進行分組[10],預后不良亞組(>2分,n=24),預后良好亞組(≤2分,n=66)。

2 結 果

2.1 3組血清骨鈣素、SIRT6水平比較 與健康對照組比較,血清骨鈣素、SIRT6水平AIS組均降低(t/P=25.013/<0.001、27.571/<0.001),非AIS組比較差異無統計學意義(t/P=2.559/0.152,3.113/0.067);與非AIS組比較,AIS組2項指標均降低(t/P=31.808/<0.001、36.440/<0.001),見表1。

表1 3組受試者血清骨鈣素及SIRT6水平比較

2.2 不同病情嚴重程度AIS患者血清骨鈣素、SIRT6水平比較 血清骨鈣素、 SIRT6水平重癥亞組<中癥亞組<輕癥亞組(t/P=7.793/<0.001、3.809/<0.001,10.987/<0.001、6.684/<0.001),見表2。

表2 不同嚴重程度AIS患者血清骨鈣素、SIRT6水平比較

2.3 不同預后AIS患者臨床指標比較 與預后良好亞組比較,預后不良亞組梗死面積大、NIHSS評分較高,血清骨鈣素及SIRT6均較低(P均<0.01);其他資料2組比較差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 不同預后AIS患者臨床指標比較

2.4 AIS患者預后影響的多因素Logistic回歸分析 以AIS患者預后為因變量(不良=1,良好=0),以血清骨鈣素、SIRT6、梗死面積、NIHSS評分為自變量進行Logistic回歸分析,結果顯示:梗死面積大、NIHSS評分高是影響AIS患者預后的危險因素,血清骨鈣素及SIRT6高是影響AIS患者預后的保護因素(P<0.01),見表4。

表4 AIS患者預后影響的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預后的評估價值 繪制血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預后的評估價值ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示: 血清骨鈣素、SIRT6及兩項聯合對AIS 患者不良預后的AUC分別為0.782、0.796、0.886,兩項聯合的AUC大于各自單獨預測效能(Z=4.526、4.209,P均<0.001),見表5、圖1。

圖1 AIS患者預后的受試者工作特征曲線分析

表5 血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預后的預測價值

3 討 論

AIS是大腦供血不足導致腦組織損傷的急性疾病,疾病早期可出現神經功能惡化,導致肢體和語言殘疾,嚴重時可導致死亡。目前影響AIS患者病情嚴重程度及預后的因素較多,如高齡、高血壓及糖尿病等[11],但目前尚無有效評估AIS患者預后的血清標志物。研究影響AIS患者預后的因素,有利于指導臨床診治。

骨鈣素是由成熟成骨細胞合成分泌的特異性非膠原蛋白,是包含49個氨基酸的小分子肽,不僅參與骨形成、骨轉換過程,其還能夠作為一種內分泌激素,參與能量代謝及雄性生殖的過程[4]。研究發現,母體骨鈣素可以穿過胎盤,促進胎兒大腦神經發生和發育,促進空間學習和記憶能力[12]。本研究中,AIS患者血清骨鈣素水平明顯降低,提示骨鈣素表達下調促進AIS的發生發展。骨鈣素不僅表達于成骨細胞,也存在于血管平滑肌細胞中,有學者研究表明血清骨鈣素降低能夠導致葡萄糖和脂肪代謝紊亂,促進血管鈣化、血管動脈粥樣硬化、血管內膜增生等的發生,增加AIS等心血管疾病的發生風險[5]。研究表明,骨鈣素表達下調增加血管內皮細胞不穩定性,促進動脈血管平滑肌鈣化,增加AIS發生的風險[13]。本研究中,AIS患者血清骨鈣素與疾病嚴重程度有關,病情程度越重,血清骨鈣素水平越低,提示血清骨鈣素水平有助于反映AIS患者疾病嚴重程度。其原因可能是骨鈣素能夠促進腦神經細胞代謝重編程,在腦缺血時發揮保護作用。實驗研究表明,骨鈣素的表達下調能夠激活脯氨酸羥化酶1,促進缺氧誘導因子1α的表達及葡萄糖的有氧氧化,加重腦缺血缺氧時神經元的損傷[14]。此外,骨鈣素水平降低還能降低循環內皮祖細胞的水平,降低其增殖和分化為血管內皮細胞的能力,缺血區新生血管生成減少,加重AIS神經損傷的嚴重程度[13]。本研究結果表明,骨鈣素高表達是影響AIS預后的保護因素。分析其原因,可能是骨鈣素能夠通過抑制AIS缺血半影區神經元的死亡,發揮神經保護作用。研究表明,骨鈣素能夠通過抑制缺血半影區神經元中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活性及Gasdermin D的表達,進而抑制神經細胞焦亡的發生,減少神經細胞的死亡及患者神經功能障礙的發生[15]。

sirtuin家族包括SIRT1～SIRT7共7個成員,具有去乙酰酶和ADP核糖轉移酶活性[16]。SIRT6主要位于細胞核中,是一種多功能表觀遺傳酶。近年研究發現,SIRT6表達降低能夠誘導血管內皮細胞衰老,抑制內皮細胞增殖及血管舒張,參與動脈粥樣硬化等的發生發展[17]。本研究結果表明,AIS患者血清SIRT6水平明顯降低,提示SIRT6表達下調促進AIS的疾病發生。有學者證實,在原代人腦微血管內皮細胞中,缺氧條件能顯著抑制SIRT6的表達,并在大腦中動脈閉塞的小鼠腦組織中觀察到SIRT6表達下調的現象[18]。有研究報道,內皮細胞SIRT6特異性敲除的AIS小鼠中,腦微血管內皮細胞凋亡顯著增加,引起血腦屏障功能障礙,同時半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的過度激活促進神經元凋亡,加重動物神經功能損傷,增加動物病死率[7]。細胞實驗也證實,缺氧/復氧損傷降低了原代人腦微血管內皮細胞中SIRT6的表達水平,損害血管內皮細胞的屏障功能,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表達增加,神經元存活途徑Akt通路受到抑制,加重AIS病情程度[7,19-20]。本研究中,血清SIRT6高表達是影響AIS患者不良預后的獨立保護因素。有學者發現,腦神經元中SIRT6的過度表達能夠上調核因子E2相關因子2的表達,增強機體抗氧化能力,減輕了缺血再灌注損傷時氧化應激誘導的腦組織損傷和神經功能缺損,而敲除核因子E2相關因子2的表達后,SIRT6則失去神經保護作用[21]。尚有學者發現,SIRT6能夠促進海馬中小膠質細胞由M1型向M2型極化,抑制神經元的氧化應激損傷,改善手術引起的認知功能障礙[22]。因此,AIS中SIRT6的表達下調參與AIS疾病的發生發展,是評估AIS患者預后的血清標志物。

綜上所述,AIS 患者血清骨鈣素、SIRT6表達降低,兩者的表達與AIS患者病情嚴重程度有關,是影響AIS患者不良預后的獨立因素。臨床醫師可根據AIS患者血清骨鈣素及SIRT6水平,對不同預后AIS患者進行風險分層,優化不良預后的AIS患者的臨床治療方案,以減輕患者神經功能損傷程度,改善患者臨床預后。此外,針對骨鈣素、SIRT6的臨床治療藥物能否有效治療AIS,改善AIS患者預后,值得今后進行深入研究。本研究為單中心研究,尚可能存在潛在影響血清骨鈣素、SIRT6水平的其他疾病,有待今后設計多中心大樣本臨床試驗,排除可能的混雜因素進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

何德英、郭富饒:提出研究思路,設計研究方案,實施研究過程,分析試驗數據,論文撰寫;潘成德:實施研究過程,資料搜集整理,論文撰寫;江思德:課題設計,進行統計學分析