重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達與病情及預后的關系

高飛 張秀梅 金小樂 薛乾隆 王慧 張志斌

重癥肺炎的病情發展迅速、死亡率較高[1-2]。呼吸衰竭是重癥肺炎最常見的合并癥，也是造成重癥肺炎患者死亡的重要因素[3]。因此，研究重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預后的評價方式具有積極的臨床意義。目前臨床上評價重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預后的常規實驗室指標包括WBC、CRP、降鈣素原（procalcitonin，PCT）等，但是在國內多項重癥肺炎相關研究中，上述實驗室指標與預后關系的多因素回歸分析結果差異較大[3-5]，目前尚缺乏能夠有效預測預后的標志物。miRNA 是近年來備受關注的一類小分子RNA，能夠分泌進入外周血并成為評價病情的標志分子。兩項急性肺損傷相關的動物實驗發現，miR-24 在急性肺損傷大鼠的肺組織中表達減少，而過表達miR-24 能夠減輕急性肺損傷大鼠的病理改變及炎癥反應[6-7]，提示miR-24 可能在肺部炎癥反應的調控中起重要作用。基于此，本研究以重癥肺炎合并呼吸衰竭患者為對象，探討患者外周血miR-24 表達與病情及預后的關系，旨在為發現新的重癥肺炎合并呼吸衰竭評價標志物提供臨床證據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年10 月至2020 年12 月河北北方學院附屬第一醫院收治的106 例重癥肺炎合并呼吸衰竭患者作為重癥肺炎組。納入標準：（1）符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》中重癥肺炎的診斷標準[8]；（2）符合第8 版《內科學》中呼吸衰竭的診斷標準[9]；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）合并肺栓塞、肺部腫瘤、肺不張、肺水腫；（2）肺結核患者；（3）3 個月內使用過抗生素、激素。選取同期本院收治的184 例普通肺炎患者作為普通肺炎組，均符合肺炎診斷且不合并呼吸衰竭、未達到重癥肺炎標準。選取同期在本院體檢的100 名健康志愿者作為對照組。3 組研究對象性別、年齡、BMI、吸煙比例比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經河北北方學院附屬第一醫院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：W20180027）。

表1 重癥肺炎組患者miR-24表達水平與病情評價指標的相關性分析

表1 3組研究對象一般資料比較

1.2 外周血miR-24 表達水平檢測 采用熒光定量PCR 法。抽取3 組研究對象外周靜脈血5 mL，采用北京天根生物公司生產的試劑盒進行檢測。首先，采用miRNA 提取分離試劑盒（批號：DP501，北京天根生化科技有限公司）提取外周靜脈血中的miRNA，而后采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：KR211，北京天根生化科技有限公司）將外周靜脈血miRNA 反轉錄為cDNA。最后采用miRNA 熒光定量檢測試劑盒（批號：FP411，北京天根生化科技有限公司）對cDNA中miR-24 表達水平進行檢測，根據試劑盒說明書配置反應體系：cDNA 2 μL、反應混合液10 μL、10 μmol/L 上游和下游引物各0.6 μL、去離子水補足體系至20.0 μL。將反應體系放入熒光定量PCR 儀（型號：7500，賽默飛世爾科技公司），設置反應程序如下：95 ℃預變性3 min，而后95 ℃5 s、60 ℃15 s 重復40 個循環，得到循環曲線和循環閾值。以U6 為內參，根據2－ΔΔCt法計算miR-24 表達水平。

1.3 重癥肺炎病情的評價及預后分組 查閱重癥肺炎患者的病歷，根據以下實驗室檢查指標評估病情：WBC、CRP、PCT、PaO2、PaCO2、pH 值、碳酸氫根（HCO3－）及急性生理學及慢性健康狀況評分系統Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）。WBC 采用血常規儀（型號：BC-7500，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）檢測，CRP、PCT 采用全自動生化分析儀（型號：BS-600M，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）檢測，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－采用動脈血氣分析儀（型號：RAPIDPoint?500e，西門子醫療系統有限公司）檢測，根據入院后24 h內各項指標的最差值計算APACHE Ⅱ評分。根據治療結局將重癥肺炎合并呼吸衰竭患者的預后分為存活和死亡。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關分析重癥肺炎組患者miR-24 表達水平與病情評價指標的相關性；采用多因素Cox 回歸分析重癥肺炎組患者預后的影響因素；采用ROC 曲線評估miR-24 表達水平對重癥肺炎組患者預后的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組研究對象外周血miR-24 表達水平比較 重癥肺炎組、普通肺炎組和對照組外周血miR-24 表達水平分別為0.70±0.19、0.86±0.25、1.00±0.21，3 組比較差異有統計學意義（F=53.060，P＜0.001），其中重癥肺炎組低于普通肺炎組及對照組（均P＜0.05），普通肺炎組低于對照組（P＜0.05）。

2.2 重癥肺炎組患者miR-24 表達水平與病情評價指標的相關性分析 Pearson 相關分析顯示，重癥肺炎組患者miR-24 表達水平與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分均呈負相關（均P＜0.05），與PaO2呈正相關（P＜0.01），與WBC、PaCO2、pH 值、HCO3－均無相關性（均P＞0.05），見表1。

2.3 重癥肺炎組存活與死亡患者病情評價指標及miR-24 表達水平比較 重癥肺炎組死亡患者CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分均高于存活患者，PaO2、miR-24 表達水平均低于存活患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而重癥肺炎組存活與死亡患者WBC、pH 值、PaCO2、HCO3－比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 重癥肺炎組存活與死亡患者病情評價指標及miR-24表達水平比較

2.4 重癥肺炎組患者預后影響因素的多因素分析以重癥肺炎組患者預后作為因變量（賦值：存活=0、死亡=1），以PCT（連續變量）、CRP（連續變量）、PaO2（連續變量）、miR-24（連續變量）、APACHE Ⅱ評分（連續變量）作為自變量，對重癥肺炎組患者預后的影響因素進行多因素Cox 回歸分析，結果顯示PaO2、APACHEⅡ評分、miR-24 均是重癥肺炎組患者預后的影響因素（均P＜0.05），見表3。

表3 重癥肺炎組患者預后影響因素的多因素分析

2.5 miR-24 表達水平預測重癥肺炎組患者預后的ROC 曲線分析 ROC 曲線分析顯示，miR-24 表達水平預測重癥肺炎組患者預后的最佳截斷值為0.639，AUC為0.780（95%CI：0.711～0.889），靈敏度和特異度分別為0.659 和0.826，提示miR-24 表達水平對重癥肺炎組患者的預后具有預測價值，見圖1。

圖1 miR-24 表達水平預測重癥肺炎組患者預后的ROC 曲線

3 討論

重癥肺炎是臨床常見的呼吸系統危重癥，救治難度大、死亡率高[10-12]。國內多項關于重癥肺炎預后的研究發現，重癥肺炎預后的影響因素復雜，合并呼吸衰竭、接受機械通氣、PaO2降低、APACHEⅡ評分增加、心率加快等均是重癥肺炎患者死亡的危險因素[3-5]。不同研究中呼吸衰竭及機械通氣對重癥肺炎患者預后影響的分析結果一致，但關于其他生命體征、實驗室指標、評分等對重癥肺炎患者預后影響的回歸分析結果差異較大[3-5，13-15]，這不僅增加了臨床上評價重癥肺炎病情及預后的難度，也對尋找評價重癥肺炎患者、尤其是重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預后的標志物提出了新要求。

miRNA 是近些年備受關注的一類非編碼小分子RNA，生物學作用廣泛，參與增殖、凋亡、炎癥、氧化應激等多個生物學環節的調控。Wu 等[16]研究顯示重癥肺炎患者外周血中多種miRNAs 表達改變且對患者急性呼吸窘迫的發生具有一定的預測價值。miR-24 是在多種組織中發揮保護作用的一種miRNA。心腦血管相關的研究證實，miR-24 能夠減輕心肌缺血再灌注損傷、七氟醚誘導神經元損傷[17-18]。急性肺損傷相關的研究證實，miR-24 在急性肺損傷模型大鼠的肺組織中表達降低，過表達miR-24 顯著減輕急性肺損傷模型大鼠肺組織的病理改變及炎癥反應[6-7]。在上述miR-24 動物實驗的基礎上，本研究分析了重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達的變化并發現：與普通肺炎患者及健康志愿者比較，重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血中miR-24 呈低表達，提示miR-24 低表達與重癥肺炎合并呼吸衰竭的發病有關。

結合miR-24 在急性肺損傷大鼠中的保護及抗炎作用進行分析，重癥肺炎合并呼吸衰竭發病過程中低表達的miR-24 能夠削弱其保護及抗炎作用，進而造成肺損傷及炎癥反應的加劇。為了進一步驗證miR-24在重癥肺炎合并呼吸衰竭發病過程中對病情的影響，本研究進行了相關性分析，選擇WBC、CRP、PCT 3 項指標用于評價炎癥反應程度，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－4 項指標用于評價肺泡氧合功能及肺損傷程度，APACHE Ⅱ評分用于評價整體病情，分析結果顯示：miR-24 與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分均呈負相關，與PaO2呈正相關，表明重癥肺炎合并呼吸衰竭患者miR-24 的低表達與炎癥反應加劇、肺泡氧合功能減退、整體病情加重有關，符合miR-24 介導的肺組織保護及抗炎作用。

本研究對比了重癥肺炎組死亡與存活患者的miR-24 表達及病情，并進行多因素Cox 回歸分析，結果發現，PaO2、miR-24、APACHE Ⅱ評分是重癥肺炎合并呼吸衰竭患者預后的影響因素。其中PaO2、APACHE Ⅱ影響預后的分析結果與國內王新平[19]的研究結果一致；而miR-24 影響預后的可能機制是miR-24 表達的變化加重了病情。最后，通過ROC 曲線分析證實miR-24 表達水平對重癥肺炎合并呼吸衰竭患者的預后具有預測價值。

綜上所述，本研究結果表明重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達水平降低與病情加重及預后惡化有關，并且miR-24 表達水平對患者的預后具有預測價值。當然，本研究也存在一定的不足之處：（1）重癥肺炎組患者較少且均來自同一中心，會存在一定的選擇偏倚，今后將開展多中心、大樣本的隨機對照研究以獲得更確切的研究結論；（2）miR-24 不是臨床常規開展的檢驗項目，這無疑制約了該指標的臨床應用價值，待今后檢測手段進步、在臨床推廣后，miR-24有望成為評估重癥肺炎病情的臨床標志物。