卵母細胞與顆粒細胞的交互作用

黎 婷

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學院,安徽 蕪湖 241000)

哺乳動物卵子發(fā)生起源于胚胎階段,首先發(fā)育成為生殖祖細胞(primordial germ cells,PGCs),當PGCs遷移到胚胎性腺后發(fā)育成為卵原細胞,開始進行減數(shù)分裂成為卵母細胞,并停留在雙線期,個別卵母細胞被單層扁平顆粒細胞包繞形成原始卵泡[1].之后當卵母細胞開始生長,單層扁平顆粒細胞變?yōu)榱⒎叫?并增殖形成多層次結(jié)構(gòu),被泡膜間質(zhì)細胞包繞,從而形成次級卵泡,次級卵泡繼續(xù)發(fā)育形成卵泡腔,成為有腔卵泡,而顆粒細胞分化形成卵丘顆粒細胞,圍繞次級卵母細胞行成卵丘.雌性動物開始發(fā)情后,周期性分泌促性腺激素促進囊狀卵泡中的卵母細胞完全成熟,繼續(xù)完成減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ,繼而排卵[2-3].

卵泡的發(fā)育受到下丘腦-腦垂體-卵巢軸中不同水平的激素調(diào)控,主要有下丘腦分泌促性腺素釋放激素、垂體前葉分泌促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)促黃體素(luteinizing hormone,LH).卵巢產(chǎn)生雌激素[4].FSH刺激顆粒細胞增和顆粒細胞內(nèi)的芳香化酶的活性,使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,增加雌激素的水平和促進子宮內(nèi)膜的增殖,可用于誘發(fā)排卵或超排卵.初級卵泡到腔前卵泡中都表達FSH受體,受其促生長和抗凋亡作用形成有腔卵泡,FSH在卵泡發(fā)育中發(fā)揮主導作用[5].

在發(fā)現(xiàn)卵母細胞內(nèi)源性生長因子之前,普遍認為卵母細胞的生長是受到單向調(diào)控,顆粒細胞提供營養(yǎng)成分,而FSH調(diào)控顆粒細胞的增殖[6].通過內(nèi)分泌學和超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),位于卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙結(jié)合部存在物質(zhì)轉(zhuǎn)運,二者之間有豐富的物質(zhì)聯(lián)系,如顆粒細胞通過縫隙結(jié)合部提供小分子物質(zhì),如營養(yǎng)素、分子信號等調(diào)節(jié)卵母細胞發(fā)育和成熟,卵母細胞產(chǎn)生自源性生長因子GDF9和BMP15,卵泡發(fā)育受到卵母細胞和顆粒細胞的雙向調(diào)控[7].

1977年,Eppig[8]使用卵母細胞體外培養(yǎng)體系首次進行系統(tǒng)性研究,利用未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)獲得成熟卵母細胞的新技術(shù).近年來已有體外培養(yǎng)小鼠、牛等多種動物的胚胎干細胞和誘導多潛能干細胞,獲得成熟卵母細胞的研究報道[9].該繁殖技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于試管嬰兒、遺傳改良等人和動物的生殖研究,以期改善人類生活、產(chǎn)生更大的經(jīng)濟效益[10].

1 顆粒細胞對卵母細胞的作用

1.1 卵母細胞和顆粒細胞間的結(jié)構(gòu)連接

原始卵泡外周被前顆粒細胞直接圍繞,進入生長期后很快產(chǎn)生透明帶包繞卵母細胞,將其與顆粒細胞隔開,而顆粒細胞會形成胞質(zhì)突,穿過透明帶,仍和卵母細胞維持一定的直接接觸[11].大部分胞質(zhì)突由富含肌動蛋白絲的主鏈構(gòu)成,小部分由微管蛋白構(gòu)成,因此顆粒細胞層中遠層的顆粒細胞仍能保持和卵母細胞的直接聯(lián)系[12].胞質(zhì)突的數(shù)量和形狀隨著卵泡發(fā)育發(fā)生動態(tài)變化,促進卵母細胞生長,在體外培養(yǎng)中胞質(zhì)突顯著減少,添加雌二醇和FSH可緩解胞質(zhì)突的減少,提高卵母細胞體外培養(yǎng)成熟率[13].

在胞質(zhì)突的頂端,顆粒細胞與卵母細胞之間的縫隙結(jié)合部,形成胞間通道,允許離子和小分子物質(zhì)(<1kDa)直接通過,縫隙結(jié)合部由連接蛋白類組成,6個連接蛋白寡聚體化形成1個連接子,相鄰細胞間(卵母細胞和顆粒細胞間、卵泡的顆粒細胞間)的兩個連接子組成通道,從而形成縫隙結(jié)合部[14].另外一些觀點認為,顆粒細胞、卵泡(包括卵母細胞,不包括泡膜細胞,二者被基膜分離)形成功能性胞體,小分子物質(zhì)如氨基酸、核酸、代謝產(chǎn)物和cAMP等都通過顆粒細胞的縫隙結(jié)合部,與卵母細胞進行物質(zhì)交換,這對卵泡發(fā)育至關(guān)重要,如小鼠卵母細胞不能合成Cx37(Connexin37,細胞連接蛋白37),卵母細胞只能發(fā)育為正常體積的74%,不能完成減數(shù)分裂,卵泡也不能發(fā)育為成熟的格拉夫卵泡[15-16].

1.2 氨基酸類和能量底物

顆粒細胞可以通過縫隙結(jié)合部運送營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸類)和能量物質(zhì)(能量底物)給卵母細胞,目前在小鼠生長卵母細胞中的6種氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)已被確定,顆粒細胞顯著增強其中甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和牛磺酸的攝取量[17].小鼠、牛、羊和人等動物的卵母細胞可以通過葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)攝取葡萄糖,但由于缺乏糖酵解酶中的果糖磷酸激酶,哺乳動物卵母細胞利用葡萄糖作為能量底物的能力很低[18].因此,大多數(shù)哺乳動物卵母細胞的能量底物來源于顆粒細胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為卵母細胞可利用的物質(zhì),如丙酮酸鹽、乳酸鹽、NADPH等,以滿足卵母細胞的生長需求,而不是直接利用葡萄糖.體外培養(yǎng)卵母細胞的生長速率與共培養(yǎng)的顆粒細胞數(shù)量呈顯著正相關(guān),如小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)體系中沒有顆粒細胞時,直徑到35 μm即停止生長,正是因為顆粒細胞通過縫隙結(jié)合部進行的氨基酸類和能量底物轉(zhuǎn)運,對卵母細胞的活力和生長有著至關(guān)重要的作用[19].

1.3 cAMP和cGMP

原始卵泡中卵母細胞生長期到減數(shù)分裂Ⅰ期即停滯,而卵泡在FSH和LH作用下繼續(xù)成熟,原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡,甚至早期有腔卵泡中的卵母細胞都沒有繼續(xù)進行減數(shù)分裂的能力[20].而在生長期最后由于促性腺激素的作用,卵母細胞以分段式完成減數(shù)分裂,到達減數(shù)分裂Ⅱ期[21].這種減數(shù)分裂的分段式完成受到卵泡環(huán)境和顆粒細胞的抑制作用,卵泡排卵后由于擺脫了卵泡環(huán)境和顆粒細胞的抑制,即使沒有促性腺激素,卵母細胞可自發(fā)完成減數(shù)分裂[22].研究發(fā)現(xiàn),卵母細胞自發(fā)完成減數(shù)分裂是胞內(nèi)cAMP水平下降引起的.顆粒細胞通過縫隙結(jié)合部給卵母細胞運送cGMP,cGMP抑制磷酸二酯酶3(cAMP水解酶),從而維持卵母細胞胞內(nèi)高cAMP水平阻斷減數(shù)分裂,這些環(huán)核苷酸對卵母細胞的減數(shù)分裂起到負反饋調(diào)節(jié)作用[23].

cAMP和cGMP分別由腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶合成,磷酸二酯酶類可降解cAMP和cGMP.研究發(fā)現(xiàn),cAMP及卵泡液(主要是其中的次黃嘌呤)協(xié)作使小鼠卵母細胞無法停留在減數(shù)分裂Ⅰ期,次黃嘌呤抑制cAMP水解酶-磷酸二酯酶的活性[24].顆粒細胞中主要的鳥苷酸環(huán)化酶是鈉尿肽受體2,是配體利鈉肽的受體,使用利鈉肽處理卵丘-卵母細胞復合體,可提高cGMP水平,敲除利鈉肽或其受體基因的小鼠卵母細胞無法停留在減數(shù)分裂Ⅰ期,最終早熟早衰[25].

1.4 旁分泌因子

顆粒細胞分泌可分泌多種物質(zhì),調(diào)控卵母細胞的生長和成熟,顆粒細胞生成的雌激素類可刺激自身增殖,分泌的旁分泌生長因子可直接刺激卵母細胞的生長,生成的激活素和抑制素均屬于轉(zhuǎn)化生長因子β家族,發(fā)揮調(diào)控腦垂體分泌FSH的作用[26].目前研究最多的調(diào)控粒層-卵母細胞交互作用的配體受體系統(tǒng)是酪氨酸激酶及其受體,對卵母細胞和卵泡的所有發(fā)育階段都起到促進作用,可能也與原始卵泡中休眠卵母細胞的喚醒有關(guān)[27-28].

2 卵母細胞與卵泡發(fā)育

2.1 卵源因子:GDF9和BMP15

實施顯微操作卵子去除術(shù)會引起顆粒細胞的黃體化,說明一些卵源物質(zhì)可能阻止顆粒細胞的自發(fā)黃體化,證實了卵源物質(zhì)對顆粒細胞功能的直接影響,這些實驗結(jié)論是基于排卵后顆粒細胞黃體化的生理學現(xiàn)象[29].卵母細胞對顆粒細胞的作用與卵源物質(zhì)調(diào)控糖酵解和三羧酸循環(huán)有關(guān),從而調(diào)控顆粒細胞的功能[30].研究發(fā)現(xiàn)卵母細胞生成的特異性生長因子調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育,GDF9敲除小鼠的原始卵泡發(fā)育到形成1-2層顆粒細胞包繞即停止發(fā)育,而BMP15敲除母鼠生育力低下,免疫抑制GDF9和BMP5會顯著減少有腔卵泡的數(shù)量,最終證實了兩種卵源因子GDF9和BMP15的存在及對其顆粒細胞和卵泡發(fā)育的影響,GDF9和BMP15均屬于轉(zhuǎn)化生長因子β家族[31-32].

2.2 顆粒細胞的增殖和形態(tài)學研究

每個原始卵泡都包含一個卵母細胞及包繞在外的單層扁平顆粒細胞,當卵母細胞開始生長,顆粒細胞從扁平變?yōu)榱⒎叫?并隨著卵泡的發(fā)育開始增殖.體內(nèi)外實驗顯示,無腔卵泡中顆粒細胞的增殖受FSH和雌激素17β促進,無腔卵泡和有腔卵泡的顆粒細胞都受卵母細胞分泌的GDF9和BMP15促進,大量增殖從而形成卵丘[33].

實驗發(fā)現(xiàn),體內(nèi)顆粒細胞與體外培養(yǎng)顆粒細胞的外形有所差異,體外顆粒細胞外形類似成纖維細胞,這種形態(tài)學的改變可能是由于FSH、cAMP類似物和生長因子的作用因引起的[34].近期研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)牛卵丘(去除卵母細胞)與顆粒細胞,單獨添加BMP15與不添加GDF+BMP15的情況下,顆粒細胞都分化為類似成纖維細胞,而添加GDF+BMP15后外形變?yōu)榱庑?與不添加GDF+BMP15體外培養(yǎng)的卵丘-卵母細胞復合體中的顆粒細胞形態(tài)相似,顯示卵母細胞通過GDF9和BMP15維持顆粒細胞的外形[35].顆粒細胞具有高度分化潛能,在體外培養(yǎng)時可分化為多種細胞系,如成骨細胞、軟骨細胞和神經(jīng)細胞,卵源生長因子對于維持顆粒細胞的外形是必需的[36].

2.3 卵泡腔的形成

在卵泡發(fā)育后期,卵泡液開始積聚在顆粒細胞層之間形成的一個單獨空間就是卵泡腔.卵泡腔是哺乳動物的特有結(jié)構(gòu),可能與哺乳動物卵生及卵巢中卵泡的選擇性發(fā)育有關(guān).無腔卵泡體外培養(yǎng)實驗顯示,添加FSH可刺激卵泡腔的形成;去除了卵母細胞的無腔卵泡無法形成卵泡腔,添加GDF9和BMP15會形成卵泡腔類似結(jié)構(gòu),證實卵母細胞可能通過GDF9和BMP15參與了卵泡腔的形成[37].

3 結(jié) 論

哺乳動物卵巢、卵母細胞生長和卵泡發(fā)育是一個協(xié)調(diào)發(fā)生的漫長過程,以期排卵后產(chǎn)生具有受孕能力的卵子.在這個過程中,停留在減數(shù)分裂Ⅰ期的卵母細胞隨著顆粒細胞增殖、分化和有腔卵泡的發(fā)育重新開始減數(shù)分裂,同時在腦垂體作用下卵母細胞促進了卵泡的發(fā)育及顆粒細胞的增殖和分化.這種雙向交互作用一通過卵源因子GDF9和BMP15調(diào)控顆粒細胞增殖、分化及顆粒細胞cAMP及cGMP合成量,二通過顆粒細胞經(jīng)縫隙結(jié)合部運送cAMP及cGMP給卵母細胞調(diào)控卵母細胞生長發(fā)育及卵母細胞GDF9和BMP15的合成量得以實現(xiàn).最終保證卵母細胞和卵泡生長發(fā)育的協(xié)調(diào)性,以及哺乳動物個體正常的卵巢功能,產(chǎn)生具有受孕能力的卵子.卵母細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)需要更成熟的條件才能完善卵母細胞的全部生長過程,對卵母細胞和顆粒細胞交互作用的研究是為了更好的改進體外培養(yǎng)系統(tǒng),從而掌握這項生殖技術(shù),更好的為人類服務(wù).