基于多基因構建胰腺癌預后模型及臨床價值

高過，華永飛，江寅，王高卿

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是發病率和死亡率逐年上升的惡性腫瘤之一[1]。其是一個高度異質性的惡性腫瘤[2]，傳統的分期如TNM 分期，在預測患者生存差異方面并未表現出很好效果[3]。精準醫學為PC患者的治療提供了許多有價值的參考，也讓個體化治療成為了現實[4-5]。二代測序技術的使用，使利用相關特征對患者進行風險分層成為了可能[6]。本研究通過不同數據集獲得了和PC 預后相關的基因，并建立了著絲粒蛋白E（centromere protein E，CENPE）、肌動蛋白結合蛋白（anillin，actin binding protein，ANLN）和細胞骨架相關蛋白2 類似物（cytoskeleton associated protein 2 like，CKAP2L）在內的預后模型，適用于指導患者預后評估和治療決策，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源 本研究嚴格遵守根據赫爾辛基宣言，所使用的數據來源于 TCGA（https://portal.gdc.com）、ICGC（https://dcc.icgc.org/releases/current/Projects）和HPA（https://www.proteinatlas.org/）數據庫。本研究從ICGC 和TCGA 數據庫獲取PC 的RNAseq 數據（level3）和相應的臨床信息，從GTEx V8 版數據庫（https://gtexportal.org/home/datasets ）獲取正常胰腺組織RNAseq 數據，從HPA 數據庫獲取相關蛋白在PC 中表達的免疫組化結果。

1.2 篩選和PC 預后相關的基因 基于ICGC 數據庫所獲取的兩個數據集中PC 的RNAseq 數據（level3）和相應的臨床信息，通過單因素Cox 回歸分析與PC預后相關的基因，兩個數據集取交集并結合文獻資料最終選擇所要研究的目的基因。

1.3 目的基因在PC和正常胰腺組織中的表達水平通過TCGA 數據庫進一步驗證所篩選出的目的基因在PC 和正常胰腺組織中的表達水平。從TCGA 數據庫獲取在PC 及癌旁組織中RNAseq 數據（level3），從GTEx 數據庫獲取正常胰腺組織RNAseq 數據。

1.4 目的基因表達水平對PC 患者預后的影響 基于TCGA 數據庫獲取的數據，進一步驗證目的基因對PC 患者預后的影響。

1.5 構建基因相關的預后模型 基于1.4 中所獲取的TCGA 數據集，使用R 包“glmnet”執行Lasso Cox回歸以及10 倍交叉驗證；采用R 軟件survival 包進行多因素Cox 回歸分析構建預后模型。

1.6 基因預后模型獨立于其他臨床因素 為了證明PC患者存在其他臨床變量影響預后，本研究進行了單因素和多因素Cox 回歸分析，將臨床特征和基因預后模型設置為自變量，將總體生存時間（overall survival，OS）設置為因變量。

1.7 構建和驗證列線圖 為了提高模型的適用性，將具有預后能力的臨床變量與基因特征模型相結合，并應用列線圖來預測PC 患者的預后。基于單因素和多因素Cox 回歸分析選擇所有獨立預后因素來構建列線圖來評估PC 患者1 年OS 的概率。使用R包“timeROC”獲得1 年OS 的ROC 曲線和AUC。

1.8 統計方法 采用R V4.0.3 軟件進行統計學分析，使用的R 包主要包括survival、survminer、timeROC、glmnet 和rms 等。兩組間基因表達水平的比較采用Wilcox檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PC 差異表達基因 通過ICGC 數據庫中的兩個數據集篩選與PC 預后相關的差異基因，其中澳大利亞數據集和加拿大數據集分別獲取了2 355 和2 828 個差異差異基因，將兩個數據集所獲差異基因最顯著的前30 個基因取交集，最終獲得3 個候選目的基因，分別CENPE、ANLN 和CKAP2L，見圖1。

圖1 差異表達基因

2.2 差異基因在PC 和正常組織中的表達水平 基于TCGA 和GTEx 數據集比較2.1 中所選3 個差異基因的表達水平，結果顯示相比正常胰腺組織，CENPE、ANLN 和CKAP2L 在胰腺癌組織中的表達明顯升高（均P ＜0.05），見圖2。HPA 數據庫的免疫組織化學染色結果也提示CENPE、ANLN 和CKAP2L蛋白表達水平呈強陽性，見圖3。

圖3 CENPE、ANLN和CKAP2L蛋白在胰腺癌中的表達（IHC染色，×4）

2.3 差異基因表達水平與PC不良預后的相關性 基于TCGA 數據集進一步驗證和分析CENPE、ANLN和CKAP2L 的表達對PC 患者OS 的影響，結果顯示高表達CENPE、ANLN、CKAP2L 的PC 患者的中位OS 短于低表達患者（均P ＜0.05），見圖4。

2.4 構建預測模型 使用TCGA 數據集生成了基于上述三個基因表達的預測模型，隨后計算了三個基因表達風險評分，根據風險評分截斷值，89 例患者被分為高風險組，其余90 例患者被分為低風險組?；谌齻€基因的兩組K-M 曲線提示高風險組的預后明顯短于低風險組（P ＜0.05）。預后模型的1 年生存時間的AUC 為0.67，見圖5。

圖5 以最佳截斷點為界，高風險組的總生存率低于低風險組

2.5 構建和驗證列線圖 采用單因素和多因素Cox回歸分析來檢測基于三基因的預后模型在TCGA隊列中的獨立預測能力。單因素Cox 回歸分析結果提示：預后模型、年齡、腫瘤分級（分化程度）和放療具有預后價值，而其他變量與OS 沒有顯著相關；將上述具有統計學差異的變量納入到多因素Cox回歸分析，顯示預后模型和放療是獨立預后因素（均P ＜0.05），見表1。

表1 單因素和多因素Cox 回歸分析

為了使預后模型適用于臨床，應用列線圖來預測TCGA 隊列中患者1 年OS 的概率，列線圖中的預測因素包括預后模型和放療，1 年OS概率校準圖提示列線圖性能較好，見圖6。進一步計算了相應模型預測1 年OS 的AUC 為0.78，見圖7。

圖6 列線圖的構建和驗證

圖7 列線圖模型預測PC 患者1 年OS 的時間依賴性ROC 曲線

3 討論

PC是最常見的癌癥死亡原因之一，長期存活率仍然很低，隨著治療水平的不斷提高，雖然在一定程度上改善了PC 患者的預后，但通過危險分層識別高危患者將更有助于提高PC 患者的存活時間?；虻漠惓１磉_是腫瘤始發的內在因素，篩選出PC中異常表達的基因對于開發新標記物和構建腫瘤預后模型至關重要。本研究利用不同數據集篩選出與PC預后密切相關的差異表達基因，進而構建了多基因預后模型，并且納入了相關臨床因素形成了具有較好預測能力的列線圖。

本研究結果顯示CENPE、ANLN 和CKAP2L 與PC 密切相關。CENPE 是著絲粒的核心成分，在有絲分裂過程中將染色體連接到紡錘體微管上，在紡錘體微管捕獲和染色體會聚中發揮作用[7-8]。相關研究已發現CENPE與多種腫瘤的惡性表型有關，如肺癌[9]、食管癌[10]、乳腺癌[11]和視網膜母細胞瘤[12]等。紫杉醇和秋水仙堿通過抑制有絲分裂紡錘體可塑性來抑制腫瘤細胞分裂，而CENPE蛋白在有絲分裂過程中起著重要作用，因此，CENPE 很可能成為實體腫瘤治療的靶點[13]。本研究也發現CENPE 在PC 組織中表達明顯升高，且與PC 患者的不良預后相關，與Güven[14]研究結果相符。

既往相關研究已發現[15-16]，ANLN 過表達于PC組織和細胞系中，且與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移和不良預后相關，ANLN 通過調節EZH2/miR-218-5p/LASP1 信號軸促進PC 進展，這提示ANLN 可能是潛在治療靶點。Olakowski 等[17]也發現ANLN 和HIST1H1C 在PC中高表達，并基于這兩個基于構建了預后模型且具有較好性能。本研究通過篩選也發現ANLN 明顯與PC 患者的不良預后有關，進一步提示ANLN 在PC 中的關鍵作用。

CKAP2L 是一種細胞周期相關蛋白，與許多腫瘤的進展密切相關。一項泛癌研究表明，在大多數癌癥中，CKAP2L表達和活性顯著升高，CKAP2L表達升高導致患者預后不良，并且是大多數腫瘤的獨立危險因素；高表達CKAP2L 的患者對免疫治療更加敏感，可作為預測腫瘤免疫治療的生物標志物[18]。本研究結果也顯示CKAP2L 和PC 患者的不良預后密切相關。楊潞頔[19]對CKAP2L 在PC 中的作用機制進行詳細探討，發現CKAP2L 通過調節MYC 通路促進PC 細胞的惡性表型，且促進了PC 細胞的體內成瘤和肝轉移。

基于臨床相關因素構建的PC 預后模型已被諸多研究報道，盡管所報道的模型效能較好[20-21]，但考慮基因異常在腫瘤中的關鍵作用，似乎有必要將相關異常基因納入到模型中從而更能提高其效能。本研究結合上述三基因構建的危險分層和預后模型，可以較準確對患者預后作出預測。Olakowski[17]等基于ANLN 和HIST1H1C 雙基因構建的PC 預后模型，列線圖模型的曲線下面積在0.5 年時為0.83，在1 年時為0.73，并且列線圖模型的C 指數比單獨的其他變量高0.66。說明了結合將異常表達的基因和臨床相關因素結合構建腫瘤預后模型的重要性。

然而，本研究存在一些局限性。首先，考慮到PC的預后不良，本文構建了1 年OS的預測模型；其次，由于缺乏特定的臨床數據，無法對列線圖進行外部驗證，這意味著列線圖應該使用多中心臨床試驗和前瞻性研究進一步驗證。

綜上所述，本研究使用相對嚴格的回歸模型方法確定三個基因在PC中具有預后意義，構建了包含預后模型的列線圖，以幫助臨床醫生以個性化方式治療PC 患者。

致謝 感謝TCGA、ICGC、GTEx 和HPA 數據庫提供的平臺和資源，同時感謝中南大學湘雅二醫院的武強博士在數據處理上提供的指導和幫助。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 高過：實驗操作、論文撰寫；高過、江寅：數據整理、統計學分析；江寅、王高卿、華永飛：研究指導、論文修改、經費支持