基于3D生物打印構建結直腸癌個體化藥物預測模型的研究

周波，俞甲子，孫佳澤，鄭宇鵬，楊沔

近年來，我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發病率及病死率均呈逐年上升趨勢[1]。大多數CRC患者確診時已是中晚期，其中15%～25%發生肝轉移，因此以化療和靶向治療為主的輔助治療手段愈發重要[2-3]。由于腫瘤的異質性及腫瘤微環境的復雜性，不同患者對相同藥物反應不同[4]。3D 生物打印（three-dimensional bioprinting，3DP）技術的興起為腫瘤模型的研究提供了新的具有臨床意義的平臺。依賴計算機輔助的3DP可將腫瘤細胞作為“細胞種子”，根據研究人員設計的模型精確打印，通過使用生物墨水中的活細胞快速建立具有復雜三維結構的體外“器官”，并能模擬體內的微環境[5-6]。本研究擬探討3DP技術構建的CRC個體化藥物預測模型的可靠性及指導臨床精準化治療的可行性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2023 年7—11 月寧波市醫療中心李惠利醫院收治的行CRC 根治術并行術后輔助化療患者的臨床信息和腫瘤樣本，納入標準：（1）年齡18 ～80 歲；（2）組織病理學確診CRC，且可接受放化療；（3）腫瘤標本體積較大，足夠常規病理及本研究采集；（4）術后恢復良好，無嚴重并發癥。排除標準：（1）孕婦或哺乳期婦女；（2）放化療、手術后嚴重器官損傷或無法繼續全身化療者；（3）術后無需輔助化療者。本研究獲得寧波市醫療中心李惠利醫院醫學倫理委員會批準（KY2023SL167-01），所有研究對象均同意參加本研究并簽署書面知情同意書。

1.2 模型構建 腫瘤標本切除后立刻取樣，至少1cm3，并迅速置于4℃保存液中保存，運輸至實驗室后于超凈臺中將體積較大的腫瘤樣品分成兩份，一份保存于4%多聚甲醛中備做組織學檢測，一份進行腫瘤細胞分離提取。體積較小的腫瘤樣本直接進行細胞分離提取：將樣品在含有0.2% 原代細胞抗菌劑Primocin（Invivogen，USA），1%抗生素-抗真菌劑（Gibco，USA）和10mol/L Y-27632（Sigma-Aldrich，USA）的冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中洗滌5 min×3 以避免微生物的污染，然后在冰上低溫下切成直徑＜3 mm的碎片。將樣品碎片置于冷的PBS 中轉移到15 ml 離心管中，并以1 000 r/min 離心3 min，直到上清液變得清晰。棄去上清，加入用DEME/F12 培養基配制含有1.5 mg/ml 膠原酶II 型（Gibco），1 mg/ml 分散酶II 型（Sigma-Aldrich），20g/ml 透明質酸酶（Sigma-Aldrich），0.2%原代細胞抗菌劑Primocin，1%抗生素-抗真菌劑，10mol/L Y27632 的組織消化液中，置于軌道振蕩器中在37 ℃下消化30 ～60 min。消化結束后用100m 細胞濾網（BioSharp，USA)過濾，以3 000 r/min離心5 min收集腫瘤細胞沉淀，用CRC 3DP 培養基：Advanced DMEM/F12（Gibco)培養基中含有1×B27 Supplement（Gibco)、1×N2 Supplement（Gibco)、1× GlutaMAX Supplement（Gibco)、10 mmon/L Hepes（Gibco)、50 ng/ml Human EGF（PeproTech，USA）、1.25 mM N-acetyl-L-cysteine（Sigma-Aldrich）、10 ng/ml Prostaglandin E2（Sigma-Al drich）、500 ng/ml A8301（Sigma-Aldrich）、3mol/L SB202190（Sigma-Aldrich）、10 nmol/L Gastrin （ISigma-Aldrich）、1%抗生素-抗真菌劑及0.2%Primocin）重懸后進行細胞計數。

將腫瘤細胞懸液、4%海藻酸鈉（Sigma-Aldrich)和12% 明膠（Sigma-Aldrich) 以2∶1∶2 的體積比混合配制成含有腫瘤細胞的生物墨水，其中腫瘤細胞最終密度為5×106/ml，海藻酸鈉和明膠的最終濃度為4.8% 和0.8%。將生物墨水置入裝有23 G 針頭的3 ml 螺口注射器（BD，USA）中，于4 ℃靜置30 min 使生物墨水具有可打印性。將注射器裝載于3D生物打印機（SunP Biotech，USA）的打印噴頭中，打印機噴頭和打印平臺的溫度分別預設置為20 ℃和10 ℃。在計算機中將3DP 模型設計為尺寸為6 mm×6 mm×1.2 mm 的網格狀立體結構，使用1.5 mm3/s 的打印速度按模型結構在48 孔板中進行打印，打印結束后加入3%氯化鈣溶液浸泡打印體3 min 進行化學交聯固化，用HBSS 溶液清洗1 遍后加入CRC 3DP 培養基進行培養。

1.3 CRC 3DP 模型細胞活性染色 按照Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒對培養2周的CRC3DP模型進行細胞染色，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 染色（1）HE染色：新鮮腫瘤標本及CRC 3DP模型在培養10 d 收集用于HE染色，于5%多聚甲醛鈣溶液中固定24 h后進行常規脫水，石蠟包埋，制成石蠟切片，進行HE 染色，鏡下觀察拍照。（2）免疫熒光染色：新鮮腫瘤標本于5%多聚甲醛鈣溶液中固定24 h 后進行常規蔗糖梯度脫水，OCT 包埋制成冰凍切片用于免疫熒光染色，CRC 3DP 模型培養10 d后用明膠-海藻酸鈉裂解液將打印體進行物理裂解，對打印體中形成的細胞球進行免疫熒光染色；免疫熒光染色具體步驟按免疫熒光的試劑盒說明書操作，5%山羊血清（索萊寶，中國）封閉后加入一抗小鼠抗CK7（Abcam, USA）、兔抗CK20 (Abcam)，兔抗-catenin（Abcam）, 鼠抗Ki-67（Abcam），工作濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，相對應加入熒光二抗抗兔IgG Alexa Fluor 488（Abcam）和抗兔IgG Alexa Fluor 594（Abcam），工作濃度為1∶300，室溫孵育2 h，DAPI（Sigma-Aldrich）染核10 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.5 化療藥物敏感性檢測 在CRC 3DP 模型培養7 d 后，對3DP 模型進行化療藥物敏感性測試，所用化療藥物為氟尿嘧啶（5-Fluorouracil）、奧沙利鉑（Oxaliplatin）、伊利替康（Irinotecan）3 種CRC 一線化療用藥。體外給藥濃度梯度均設置為0、0.1、1、10、50、100mol/L。使用CellTiter-Glo3DCellViabilityAssay（Promega，USA）進行細胞活性測試。

1.6 統計方法 數據采用R 軟件4.0.1 版及Graphpad prism 9.0 版分析，根據藥物劑量-反應曲線計算化療藥物的半數抑制濃度（IC50）值，根據Simpson 法則推斷AUC 值，通過將相應的AUC 值除以每個濃度范圍的最大面積來獲得歸一化的AUC。

2 結果

2.1 3DP 模型建立及形態特征 納入CRC 患者20例，成功構建3DP 模型19 例，因提取細胞量不足培養失敗1 例；腫瘤術后病理均為腺癌。體外培養發現原代CRC細胞在3DP模型中的明膠-海藻酸鈉生物墨水和CRC 3DP 培養基支持下生長狀態良好，1周內可以形成3D細胞團結構，可持續生長培養保持高度細胞活性，見圖1。

圖1 CRC 3DP 模型大體形態及活細胞染色圖（標尺=100 m，P1 及P2 為光鏡亮場，C-AM/PI 為熒光染色）

2.2 CRC 3DP 模型病理學特征與親本組織的對比 CRC 3DP 模型中CRC 細胞團染色特征與親本組織HE 染色潛在相關，從病理學層面判斷兩者具有相似同源性，見圖2A；兩者在腫瘤標記物的表達上高度一致，見圖2B。

圖2 CRC 3DP 模型病理學特征與親本組織的對比圖

2.3 CRC 3DP 模型化療藥物測試 對不同CRC 患者的3DP 腫瘤模型體外給予化療藥物Oxaliplatin、CPT-11 及5-Fu 作用72 h 后檢測細胞活性，根據檢測結果進行藥物劑量-反應曲線分析藥物敏感性，見圖3A。根據藥物劑量-反應曲線計算標準化的AUC值可發現3DP 腫瘤模型藥物敏感性具有顯著異質性，見圖3B。

圖3 CRC 3DP 藥物藥物劑量-反應曲線及藥物敏感性異質性

2.4 CRC 3DP 模型化療藥物敏感性分析 將IC50＜25%藥物濃度（test drug concentration，TDC）定義為敏感（3 種藥物均無抑制的定義為耐藥型，否則定義為敏感型），篩選出化療藥物敏感型12 例，耐藥型7 例。初步發現2 例3DP 腫瘤模型提示耐藥的伴肝轉移的患者行腸癌根治術+輔助化療2 ～3 個療程后病情進展迅速，影像學提示肝轉移灶明顯增大，見封三圖5A；2 例3DP腫瘤模型提示敏感的伴肝轉移的患者術后行輔助化療病情明顯緩解，影像學提示肝轉移灶明顯縮小，見封三圖5B。

圖5 2例化療后進展及2例化療后緩解患者影像學檢查結果

3 討論

目前二維（2D）培養是一種重要的藥物篩選模型，但在實踐中，在2D 培養模型中具有顯著抑瘤作用的抗腫瘤藥物應用到人體后，其藥理作用并不好[7]。3D培養模型在一定程度上克服了2D培養的平面結構在空間上的局限性，但腫瘤細胞只是一層一層堆疊的，細胞之間沒有建立真正的空間結構，細胞之間仍然缺乏真正3D 結構意義上的相互作用[8]。患者衍生的異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型保持了原始異質性患者腫瘤的特征，已被證明有助于預測腫瘤的藥物敏感性或耐藥性。然而，PDX模型具有周期長、成功率低、價格高、異種腫瘤微環境等難以理想化的缺點。近年來，患者來源的腫瘤器官（patient-derived tumor organoid，PDTO）作為臨床前癌癥模型被廣泛研究，用于藥物篩選[9-10]。PDTO 的主要問題包括缺乏標準化的方法，類器官培養復雜，操作不可重復性以及較高的成本都是不容忽視的[9-12]。

3DP 以細胞和生物材料為基本單元，按仿生形態學、細胞特定微環境等要求打印獨特的三維生物結構體。在打印過程中，活細胞、細胞外基質成分、生物材料和生長因子通過打印實現空間可控排列組裝，體外制造可模擬體內微環境的復雜結構[13-14]。3DP 技術可根據不同個體、不同組織的微環境特征定制打印個性化的體外生物學模型。這就克服了傳統類器官技術的限制，并且在構建多細胞微環境方面具有天然優勢。

本研究結果顯示，3DP 預測模型中的原代腫瘤細胞具有3D結構生成能力，腫瘤體積變化小且均勻分布。3DP 技術的優勢在于更低的成本、更簡潔有效的建模過程、更好地保持腫瘤細胞的活力和更高的建模成功率，使得3DP 預測模型更有希望應用于癌癥基礎研究和臨床藥物預測。本研究中，親本腫瘤細胞的數量過少是建模的最大制約，1 例患者因內鏡下鉗取腫瘤標本少導致原始腫瘤細胞不足而建模失敗。病理層面發現CRC 3DP 模型中CRC 細胞團染色特征與親本組織HE 染色潛在相關，進一步的免疫熒光檢測發現結直腸癌3DP 體外腫瘤模型保留了配對的親本腫瘤的組織學特征，兩者相似表達CK7、CK20、Ki-67、-Catenin等標志物，提示3DP預測模型具備良好可靠性，其藥物反應能較好地代表親本腫瘤。本研究臨床藥物敏感性實驗提示，3DP預測模型對各種化療藥物的反應存在顯著異質性，這跟臨床實際情況也是符合的。本研究發現2 例對應3DP 腫瘤模型提示3 種藥物均耐藥的伴有肝轉移的患者行腸癌根治術后行輔助化療后病情進展迅速，影像學提示肝轉移灶明顯增大；2 例3DP腫瘤模型提示敏感的伴肝轉移的患者行腸癌根治術+輔助化療（XELOX）2 ～3 個療程后病情進展迅速，影像學提示肝轉移灶明顯增大；另外2 例3DP 腫瘤模型提示CPT-11、5-Fu雙藥敏感的伴肝轉移的患者術后行輔助化療（XELOX）病情明顯緩解，影像學提示肝轉移灶明顯縮小。

綜上所述，基于3DP 技術成功構建CRC 個體化藥物預測模型，該模型高度保留親本腫瘤的組織學特征，并對臨床藥物反應具有異質性。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 周波、孫佳澤：實驗操作、論文撰寫；俞甲子、鄭宇鵬：數據整理、統計學分析；楊沔：研究指導、論文修改、經費支持