基于RNA測序探究發熱對巨噬細胞吞噬沙門菌極化狀態的影響

戴婷婷，馬雪寒，詹曄斐，許兆軍

傷寒是由傷寒沙門菌引起的全身性感染性疾病，包括持續性高熱（40 ～41 ℃）、特殊中毒面容及皮膚玫瑰疹等多種臨床表現，其中持續性高熱（稽留熱）為其重要的表現之一[1]。傷寒沙門菌通過污染的食物到達小腸，穿過腸黏膜進入腸系膜淋巴結，并進入血液、肝、脾和骨髓中，被巨噬細胞吞噬并大量繁殖。傷寒沙門菌感染巨噬細胞初期，細胞向M1 型分化，導致以M1 型為特征的多種細胞因子轉錄水平改變，對機體啟動急性感染期的炎癥發應和清除病原菌具有重要作用，但過度的M1 型巨噬細胞反應會引發炎癥瀑布，導致敗血癥[2]。在感染后期，巨噬細胞由M1 型轉變為以免疫修復和調節為主的M2型。引起慢性感染的細胞內細菌也可誘導巨噬細胞提前向M2 型分化，從而逃避機體的免疫反應[3-4]。傷寒患者發熱時體內感染沙門菌的巨噬細胞其極化狀態如何改變，一直以來并不清楚。因此本研究通過高通量RNA測序技術探究發熱溫度對吞噬傷寒沙門菌的巨噬細胞極化的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 小鼠單核-巨噬細胞株（J774A.1）購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，鼠傷寒沙門菌[CMCC（B）50071]由寧波市疾病預防控制中心病原微生物實驗室贈送。

1.2 巨噬細胞處理 在37、38、39 和40 ℃4 種溫度條件下制備巨噬細胞感染和未感染傷寒沙門菌的模型，共得到8 組分別為M37、M37CK、M38、M38CK、M39、M39CK、M40 和M40CK，其中CK 為對照組。傷寒沙門菌培養和熒光標記：采用營養肉湯震蕩培養至對數期，用PBS（pH 值7.2）制備1×108/ml 菌懸液。將一定細菌濃度的菌懸液與CFDA-SE染料溶液混合一定時間后，洗掉未結合的CFDA-SE，在熒光顯微鏡下觀察可明顯看見細菌發出綠色熒光。單核-巨噬細胞培養并感染傷寒沙門菌：以100∶1 的感染復數將熒光標記的對數期傷寒沙門菌加入單核-巨噬細胞培養液中，110 g 離心5 min 以促進細胞和細菌接觸，分別選擇37 ～40℃4 個溫度共孵育30min，再用預溫（與培養溫度一致，下同）的PBS 洗滌2 次，隨后換成含100g/ml慶大霉素細胞培養液孵育1h以去除細胞外細菌，最后換成含10g/ml 慶大霉素細胞培養液，培養2h。巨噬細胞吞噬沙門菌率的檢測采用Dx-FLEX流式細胞儀（美國BeckmanCoulter）進行，并使用CytExpert 流式細胞處理軟件操作分析。

1.3 RNA 文庫構建 采用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）依照說明書提取總RNA，使用Nano-Drop 2000 核酸蛋白質分析儀（美國Thermo Scientific 公司）測定總RNA 的質量和濃度，使用Agilent 2100 生物分析儀（美國安捷倫公司）評估RNA 完整性，使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒依照說明書構建轉錄組文庫。

1.4 RNA 測序和差異表達基因分析 采用llumina Novaseq6000 測序平臺對文庫進行測序，并生成150bp雙端讀序。采用fastp 軟件對fastq 格式的原始讀序進行處理，去除低質量讀序后獲得高質量讀序用于后續數據分析。使用HISAT2 軟件進行參考基因組比對，并進行基因表達量（FPKM）計算，通過HTSeq-count獲得每個基因的讀序計數。利用DESeq2 軟件進行差異表達基因分析，其中符合q值＜0.05 且|log2FC|＞1 閾值的基因被定義為差異表達基因（DEGs）。

1.5 共同差異表達基因分析 利用韋恩圖找出不同溫度條件下共同表達的差異基因，分為上調和下調。

1.6 巨噬細胞M1、M2 極化相關基因轉錄分析和趨勢分析 利用歐易云平臺轉錄熱圖和趨勢分析工具，對巨噬細胞MI、M2 極化相關基因進行轉錄水平熱圖分析和趨勢分析。

2 結果

2.1 共同差異表達基因分析 通過不同溫度處理獲得各溫度條件下的共同差異表達基因2487條，利用韋恩圖找出1256條共同上調基因，1231條共同下調基因，見圖1。

圖1 差異表達基因的共表達分析

2.2 M1 和M2 極化相關基因的轉錄分析 將共同上調基因按溫度上升作出其轉錄水平變化的熱圖，存在三簇基因對溫度的處理呈現規律變化，基因簇Ⅰ隨溫度升高表達水平逐漸下調，而與之相反，基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ隨溫度升高表達逐漸升高，見圖2。

圖2 不同溫度條件共同上調和下調基因的轉錄熱圖

將這些基因進行GO 和KEGG 富集分析，基因簇Ⅰ基因參與凋亡、模式識別受體信號通路、NF- B信號正向調控、免疫反應等過程，KEGG分析中主要參與腫瘤壞死因子（TNF）通路、Toll樣受體信號通路等過程。基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ則參與炎癥反應、免疫系統過程、抗病毒防御反應、干擾素IFN- 細胞反應和對LPS的細胞反應等與促炎反應相關的生物學過程。而KEGG 富集顯示這些基因參與調控細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、NF- B 信號通路和JAK-STAT 通路等與M1 極化相關的信號通路過程，見圖3。

圖3 共同上調基因基因簇基因GO 和KEGG 分析

與共同上調基因不同，共同下調基因中基因簇Ⅰ基因參與IL-6 的負調控過程、B 細胞的增殖等過程，但主要參與固醇和膽固醇等生物合成及脂質代謝過程。KEGG 富集分析主要有HIF-1 缺氧信號通路、脂肪酸代謝與合成信號通路，此外還包括B細胞受體信號通路、Fcy R 介導的巨噬細胞吞噬過程。而基因簇Ⅱ基因簇則主要參與細胞周期、細胞分裂、染色體分離和組裝以及DNA 損傷的細胞反應等過程，見圖4。

圖4 共同下調基因簇基因GO 和KEGG 分析

通過將促進巨噬細胞向M1 極化的信號通路組分以及下游標志性分子與以上基因簇比對，發現與M1 極化有關的大多數基因都在共同上調基因的基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ中富集，只有少數的基因在基因簇Ⅰ富集，將這些基因作轉錄水平隨溫度升高的熱圖，見圖5A，除少數基因包括TNF- 、IRF1 和CD80/CD86外隨溫度升高呈先升高后逐漸下降或持續下降趨勢，絕大多數基因隨溫度升高均逐漸上調，包括JAKSTAT1/2 信號通路組分、干擾素調節因子IRF9、誘導型一氧化氮合酶Nos2、細胞因子IL-12b和趨化因子CCL-5、CXCL-9 和CXCL-16。

圖5 與激活巨噬細胞M1 和M2 極化相關的基因變化熱圖

IL-4/IL-13-JAK1/JAK3-STAT6 信號通路、IL-10-STAT3-TGF /IL-1Ra/Arg1 和JMJD3-IRF4 通路可誘導巨噬細胞M2 極化，并抑制M1 極化。通過比對分析發現大多數M2 極化相關基因存在于共同上調基因中，而且大多數存在于基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ中，繪制轉錄水平熱圖，見圖5B。

2.3 M1 和M2 極化相關基因的趨勢分析 M1 極化相關基因表達水平隨溫度升高（低于39℃）而逐漸升高，39 ～40℃，其總體表達水平不再改變，且部分基因發生下調。與M2 極化相關的基因表達水平隨溫度升高而逐漸升高（39℃），40℃時不再增加，見圖6。

圖6 與M1 和M2 極化相關基因的顯著模塊趨勢圖

3 討論

傷寒是沙門菌感染引起的一種全身性疾病，巨噬細胞一方面在清除病原體和特異性免疫應答中發揮不可或缺的作用，但也容易成為沙門菌免疫逃逸和繁殖的場所。傷寒患者伴隨嚴重的發熱癥狀，目前尚不清楚發熱對于巨噬細胞極化的影響，探究溫度影響巨噬細胞極化狀態的調控機理，對于認識和處置傷寒熱具有重要意義。本研究通過體外感染沙門菌的小鼠單核巨噬細胞，利用不同溫度處理模擬體內發熱狀態，發現沙門菌的感染均會誘導各溫度條件下的巨噬細胞向M1 狀態極化，且隨著溫度升高（低于39℃），大多數與M1 極化相關的基因轉錄水平逐漸升高，而溫度繼續升高（40 ℃），這些基因不再發生上調，且少數發生下調。此外，溫度升高的同時，也會逐漸誘導與M2 極化相關基因的表達。因此，適當的發熱（低于39 ℃）有利于巨噬細胞發揮病原體清除的能力，而溫度過高則可能造成巨噬細胞過早向M2極化，抑制巨噬細胞的促炎功能。

以往研究發現，巨噬細胞極化為M1 狀態時，會分泌TNF，作為標志性分子發揮殺傷細菌功能[5]；同時上調細胞表面共刺激分子CD80 和CD86 的表達，促進與T 細胞的接觸并使之活化[6]。在沙門菌感染巨噬細胞早期，TNF- 信號通路也會被激活，促進巨噬細胞向M1 極化，發揮促炎功能[7]。本研究表明，較低發熱溫度（37 ～38 ℃）下沙門菌感染早期，TNF 表達量較未感染組升高，這與之前的研究一致。但隨溫度繼續升高，其表達量開始下降，提示巨噬細胞M1極化被抑制。許多微生物都有利用巨噬細胞極化過程實現免疫逃逸的能力[8]，其中沙門菌能夠誘導巨噬細胞向M2 極化，王耀楠等[9]發現腸炎沙門菌能夠通過促進PKM2-JAK2-STAT3-IL10 通路誘導巨噬細胞M2 型極化，同時鼠沙門菌能夠拮抗TNF- 通路而促進巨噬細胞向M2 極化。本研究中過高的發熱溫度（39 ～40 ℃）使TNF 轉錄水平下降，表明沙門菌可能通過拮抗TNF-通路而促進巨噬細胞M2 極化，從而逃逸免疫殺傷，這與以往的研究一致。此外，巨噬細胞作為一種抗原遞呈細胞，其表面的CD80/CD86 共刺激分子是M1 極化的標志性分子。本研究結果顯示隨發熱溫度上升，也呈現出先升高后降低的趨勢，與TNF 的變化相似。以上結果表明，不同的發熱溫度能夠激活或抑制巨噬細胞極化信號通路，從而導致不同的巨噬細胞分化命運，而這一過程是否是沙門菌所獨有的，則需要更多的證據支撐。

在傷寒感染過程中，臨床上對如何處置發熱癥狀存在一定的爭議。對一些侵襲性細菌感染，發熱一般有利于清除病原菌，抑制細菌生長[10]，也可以誘導淋巴器官中淋巴細胞動員，特別是IL-6 活化，增強免疫防御[11]，同時也能增強Ⅰ型干擾素反應，促進殺菌功能[12]。但在目前醫療實踐中，即使在程度較低的發熱狀態下，也常常進行退熱干預治療。但在小鼠膿毒癥模型中，發熱未干預組比發熱干預組可以獲得更好的呼吸功能、較低的血乳酸濃度和更長的生存期[13]。臨床上存在著“最有利于疾病恢復的發熱溫度”等疑問[14]。因此，正確對待和處置發熱有重要的臨床意義。本研究初步發現，對于鼠沙門菌感染巨噬細胞模型，較低的發熱溫度有利于巨噬細胞M1 極化，發揮殺菌能力，而溫度過高則可能誘導巨噬細胞M2 極化，使沙門菌發生免疫逃逸。這些進一步為臨床上如何處理發熱癥狀提供有益的參考。

致謝 感謝寧波市第二醫院醫學實驗部對本研究的支持

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 戴婷婷：數據整理、論文撰寫；馬雪寒：數據分析、論文修改；詹曄斐：實驗操作、論文修改；許兆軍：實驗設計、研究指導、經費支持