基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討艾草抗雞馬立克病毒的活性成分與作用機(jī)制

馬圣明，張福良，翁少亭，邢月騰，王 堯，張坤朋

（安陽工學(xué)院 河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室，河南 安陽 455000）

雞馬立克病（Marek’s disease，MD）是由馬立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）感染雞引發(fā)的一種重要的免疫抑制病及腫瘤病。MDV 感染宿主后不僅能夠誘發(fā)淋巴瘤，其導(dǎo)致的免疫抑制還極易并發(fā)或繼發(fā)感染其他病原微生物[1]。目前，尚缺乏治療MD 的有效藥物，我國防控MD 的方法主要是疫苗免疫。近年來，隨著雞群MD 疫苗長期而廣泛的應(yīng)用，在免疫壓力選擇下MDV對疫苗的免疫耐受能力不斷增強(qiáng)，流行毒株也在不斷進(jìn)化[2]。在我國，MDV 的流行也導(dǎo)致了MD 疫情的頻繁暴發(fā)，長期給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，亟需開發(fā)新型的、特異性的有效藥物或生物制劑。

中藥作為我國的民族瑰寶，在病毒性疾病的防治中具有療效顯著、毒副作用小等優(yōu)勢。艾草（Artemisia argyiLévl.et Van.）為菊科蒿屬植物，是中國傳統(tǒng)的道地中藥。研究表明，艾草藥理學(xué)作用十分廣泛，含有抗病毒、抗菌、抗腫瘤等多種有效的藥理活性成分[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是借助于在線數(shù)據(jù)庫、高通量分析及計算機(jī)模擬等手段，通過構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)-藥物網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)對天然植物中藥的活性成分、作用靶點(diǎn)與機(jī)制等進(jìn)行預(yù)測的一種有效途徑[5]。基于此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段篩選艾草的主要藥理活性成分，挖掘潛在作用靶點(diǎn)，建立艾草抗MDV 的化合物-靶標(biāo)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子對接技術(shù)，從系統(tǒng)生物學(xué)整體角度探究艾草中抗MDV 的活性成分，并探究潛在的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用艾草及其提取物治療MD提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 艾草藥理活性成分及靶點(diǎn)的篩選

登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），檢索艾草化學(xué)成分。設(shè)置口服利用度（OB≥30）和類藥性（DL≥0.18）參數(shù)，篩選具有潛在藥用價值的艾草活性成分。參考相關(guān)文獻(xiàn)，補(bǔ)充艾草黃酮類藥理活性成分異澤蘭黃素和棕矢車菊素[6-7]。利用TCMSP 平臺收集艾草活性成分對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名。

1.2 MDV相關(guān)宿主靶點(diǎn)的獲取

根據(jù)參考文獻(xiàn)，挖掘MDV 感染相關(guān)宿主基因[8]。將艾草活性成分對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和MDV宿主基因信息輸入Bioinformatics&Systems Biology數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進(jìn)行映射獲得交集靶點(diǎn)，即艾草活性成分針對MDV相關(guān)宿主的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，并繪制韋恩圖。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將艾草活性成分針對MDV 相關(guān)宿主的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入STRING 在線數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.8.0 軟件中，借助Network Analyzer 進(jìn)行拓?fù)浞治觥＿x取度、中心度、平均最短路徑變化量和接近中心性4 個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)。通過度值排序，選擇度值大于平均分的基因為核心靶點(diǎn)。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將艾草活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入Cytoscape 3.8.0 軟件，建立艾草活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。同時，利用Cytoscape 3.8.0 軟件中的Network Analyzer 功能分析網(wǎng)絡(luò)，依據(jù)度值排序，篩選艾草抗MDV的重要活性成分。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將艾草抗MDV 的關(guān)鍵靶點(diǎn)以文本形式輸入DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），閾值設(shè)定為P值小于0.05，物種選擇為Gallus，進(jìn)行GO功能分析和KEGG 通路富集分析。利用GraphPad Prism 6繪制GO 功能柱狀圖；借助Bioconductor 中的R軟件包制作KEGG Pathway氣泡圖。

1.6 分子對接

從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式。利用pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取小分子藥物的3D 坐標(biāo)文件，并轉(zhuǎn)換為PDB 格式。將靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和小分子藥物分別輸入AutoDock 軟件進(jìn)行分子對接，并計算結(jié)合自由能（Affinity）。若結(jié)合自由能小于0 kcal/mol，則表明小分子配體與受體蛋白能夠自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合自由能越低，小分子配體與受體蛋白結(jié)合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾草潛在活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索獲得135 個艾草的化學(xué)成分，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的口服利用度和類藥性參考值，篩選得到9 個化學(xué)成分。去除無靶點(diǎn)的化學(xué)成分，如4-亞甲基環(huán)烷酮（4-methylenecyloartanone）、達(dá)瑪二烯醇乙酸酯（Dammaradienyl acetate）、乙酸環(huán)阿屯酯（Cycloartenol acetate）。考慮到可能存在漏選情況，補(bǔ)充了艾草抗病毒活性成分異澤蘭黃素和棕矢車菊素，最終獲得8 個艾草活性成分（表1）。在線檢索各成分的藥理作用靶點(diǎn)，去重后共獲得156個蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

表1 艾草活性成分信息Tab.1 Information on active ingredients of Artemisia argyi Lévl.et Van.

2.2 艾草抗MDV藥物靶點(diǎn)篩選

挖掘MDV 感染相關(guān)宿主基因，去重后獲得3 651 個基因，即MDV 的潛在宿主基因靶點(diǎn)。利用Bioinformatics&Systems Biology 數(shù)據(jù)庫將艾草潛在活性成分對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和MDV 宿主基因靶點(diǎn)進(jìn)行映射獲得108個靶點(diǎn)（圖1），即艾草活性成分抗MDV的藥物靶點(diǎn)。

圖1 艾草抗MDV靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn plot of the target of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.3 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將得到的108 個靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫。選擇物種原雞（Gallus gallus），設(shè)定最低要求的互作分?jǐn)?shù)為0.9，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2）。節(jié)點(diǎn)數(shù)為107，邊數(shù)為81，預(yù)期的邊數(shù)為0，平均節(jié)點(diǎn)度值為1.51，平均局部聚類系數(shù)為0.368，數(shù)據(jù)保存為tsv 文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯怨?jié)點(diǎn)度值作為拓?fù)鋵W(xué)篩選標(biāo)準(zhǔn)繪制柱狀圖（圖3）。結(jié)果顯示，度值排名前9 位的靶點(diǎn)包括JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1、CASP3、CDK2、RB1。

圖2 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Potential target protein interaction network of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

圖3 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)度值排序Fig.3 Ranking of degree values of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.4 艾草抗MDV活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

制作108 個艾草抗MDV 潛在靶點(diǎn)與對應(yīng)的活性成分文本，輸入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果如圖4所示，網(wǎng)絡(luò)圖中紅色代表艾草的活性成分，藍(lán)色代表活性成分的作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)度值越大，圖形越大。根據(jù)度值大小最終篩選出主要活性成分槲皮素（Quercetin，MOL000098）、異澤蘭黃素（Eupatilin，MOL005734）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol，MOL000358）、棕 矢 車 菊 素（Jaceosidin，MOL000297）。結(jié)果表明，艾草抗MDV是基于多種藥理活性成分、多個靶點(diǎn)基因的協(xié)同復(fù)雜作用。

圖4 艾草-成分-靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The interaction network of Artemisia argyi Lévl.et Van.-component-target

2.5 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)蛋白GO富集分析

將篩選出的108 個艾草抗MDV 靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能分析。根據(jù)P值小于0.05，篩選到161 個生物過程條目、22 個細(xì)胞組分條目、46 個分子功能條目。對排名前10 位的GO 條目進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示，艾草抗MDV 機(jī)制涉及細(xì) 胞 核（Nucleus）、胞 漿（Cytosol）、細(xì) 胞 質(zhì)（Perinuclear region of cytoplasm）等細(xì)胞組分，并與細(xì)胞對鎘離子的應(yīng)答（Cellular response to cadmium ion）、細(xì)胞對活性氧的應(yīng)答（Cellular response to reactive oxygen species）、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控（Positive regulation of endothelial cell proliferation）等過程相關(guān)（圖5）。結(jié)果提示，艾草抗MDV 主要體現(xiàn)在細(xì)胞活性、炎癥反應(yīng)等方面。

圖5 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)蛋白GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.6 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)蛋白KEGG富集分析

對108 個艾草抗MDV 靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析（P＜0.05）。結(jié)果顯示，共富集到23 條通路，主要包括C 型凝集素受體信號途徑（C-type lectin receptor signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、細(xì)胞衰老（Cellular senescence）、p53 信號途徑（p53 signaling pathway）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）等過程（圖6）。結(jié)果提示，艾草活性成分可能通過靶向作用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等關(guān)鍵信號通路來發(fā)揮抗MDV作用。

圖6 艾草抗MDV潛在靶點(diǎn)蛋白KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.7 異澤蘭黃素與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接

選取艾草代表性活性成分異澤蘭黃素，分別與度值排名前4 位的關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN、CCND1、CDK1、IL-6進(jìn)行分子對接。結(jié)果顯示，JUN蛋白的TRP-57和TRP-76 殘 基，CCND1 蛋 白 的ARG-101、ALA-16、LYA-142 殘基，IL-6 蛋白的LYS-33 殘基，CDK1蛋白的ARG-182、ARG-179 和GLN-175 殘基與異澤蘭黃素相互作用。異澤蘭黃素與JUN 蛋白、CCND1蛋白、IL-6蛋白、CDK1蛋白的分子對接結(jié)合自 由 能（Affinity）分 別 為-6.4、-7.7、-6.2、-7.2 kcal/mol（圖7）。以上結(jié)果提示，異澤蘭黃素與JUN、CCND1、CDK1、IL-6 蛋白均能自發(fā)結(jié)合，其中與CCND1的結(jié)合能力最強(qiáng)。

圖7 異澤蘭黃素與靶點(diǎn)蛋白對接模式圖Fig.7 Docking pattern diagram of eupatilin and target proteins

3 結(jié)論與討論

近年來，伴隨著雞群MD 疫苗長期而廣泛的應(yīng)用，MDV 流行毒株不斷進(jìn)化，部分流行毒株已在一定程度上突破傳統(tǒng)疫苗免疫保護(hù)[9-10]。因此，開發(fā)有效的抗病毒藥物對于預(yù)防和控制MD 具有重要意義。目前，天然中草藥及其活性成分的生物學(xué)功能研究已成為醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于臨床。艾草是我國傳統(tǒng)道地中藥，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[4]。研究表明，艾草對流感病毒、牛病毒性腹瀉病毒、乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒等多種病毒均具有抑制效果[11-14]。然而，艾草抗病毒作用機(jī)制仍不清楚，只停留在粗提物的有效劑量水平，對其具體抗病毒活性成分、調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、作用的靶蛋白等藥理機(jī)制方面還需深入探索。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的角度分析藥物與治療對象之間的分子聯(lián)系，廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)和解釋藥物和中藥的潛在作用機(jī)制[15]。口服利用度和類藥性篩選大大提高了候選藥物的準(zhǔn)確性和有效性。根據(jù)OB≥30、DL≥0.18，篩選獲得有靶點(diǎn)的艾草潛在活性化合物6 個。研究表明，異澤蘭黃素體外能有效抑制EB 病毒增殖活性[6]。棕矢車菊素可抑制人乳頭狀瘤病毒的復(fù)制[7]。據(jù)此，補(bǔ)充了異澤蘭黃素和棕矢車菊素。通過蛋白質(zhì)互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析，艾草活性成分抗MDV 的主要作用靶點(diǎn)為JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1、CASP3、CDK2、RB1。JUN 是MARK 信號通路下游的關(guān)鍵分子，在調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[16]。CCND1起著調(diào)節(jié)CDK 激酶的作用，參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[17]。AKT1 是蘇氨酸蛋白激酶家族的一個活性蛋白，磷酸化的AKT 可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的多個進(jìn)程[18]。IL-6 是參與抗感染免疫的重要分子，病毒感染可誘導(dǎo)IL-6的釋放，并通過級聯(lián)反應(yīng)激活或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[19]。MARK 是絲裂原活化蛋白激酶，MAPK1 活化或促進(jìn)CASP3 表達(dá)，誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡[20]。

構(gòu)建艾草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，槲皮素、異澤蘭黃素、β-谷甾醇、棕矢車菊素等化合物可能是艾草抗MDV 作用的關(guān)鍵藥理活性成分。槲皮素是存在于多種天然植物中的一種黃酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗?jié)兊人幚韺W(xué)作用[21]。目前，槲皮素的廣譜抗病毒活性已被各種科學(xué)研究充分證明，如抗SARS 相關(guān)冠狀病毒、抗甲型流感病毒、抗肝炎病毒、抗埃博拉病毒和抗皰疹病毒活性等。研究表明，異澤蘭黃素在藥理學(xué)濃度下可促進(jìn)EB 病毒感染的SNU-719 細(xì)胞死亡[6]。β-谷甾醇體外預(yù)處理顯著抑制炎癥因子的表達(dá)，同時顯著減緩了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷癥狀，表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)控和抗炎活性[22]。另有研究表明，棕矢車菊素抑制人乳頭狀瘤病毒的半數(shù)有效質(zhì)量濃度為5 μg/mL，最小有效質(zhì)量濃度為10 μg/mL，且無細(xì)胞毒性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，艾草單一活性成分往往可以作用多個靶點(diǎn)蛋白，一個靶點(diǎn)蛋白又可同時被多個不同的活性成分干預(yù)。不同活性成分和不同靶點(diǎn)蛋白之間可直接或間接作用，構(gòu)成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，表明艾草抗MDV效應(yīng)可能是基于多種活性成分作用于多個靶點(diǎn)的協(xié)同作用。此外，GO 富集和KEGG 通路分析涉及細(xì)胞生長、免疫代謝等多個細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程和免疫信號途徑。因此，推測槲皮素、異澤蘭黃素、β-谷甾醇、棕矢車菊素等艾草活性成 分 可 能 以JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1 等基因為藥理作用靶點(diǎn)，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等關(guān)鍵信號通路來發(fā)揮抗MDV作用。值得一提的是，異澤蘭黃素是廣泛存在于菊科植物屬中的一種活性成分，且尤以艾草中的含量最高[4]。分子對接驗證顯示，異澤蘭黃素與核心靶點(diǎn)CCND1 的對接能力最強(qiáng)，說明CCND1可能在抗MDV中發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，預(yù)測了艾草抗MDV的活性成分及藥理作用靶點(diǎn)，分析了潛在的抗病毒分子機(jī)制，表明艾草主要活性成分異澤蘭黃素可能作用于CCND1，通過介導(dǎo)細(xì)胞周期干預(yù)細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗MDV效應(yīng)。