中國棉花審定品種SSR指紋庫的構建與綜合評價

吳玉珍，黃龍雨，周大云，黃義文，付守陽，彭軍，匡猛

中國棉花審定品種SSR指紋庫的構建與綜合評價

吳玉珍1,2，黃龍雨1,2，周大云1,2，黃義文1,2，付守陽1,2，彭軍1,2，匡猛

1中國農業科學院棉花研究所/棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室，河南安陽 455000；2三亞中國農業科學院國家南繁研究院，海南三亞 572024

【目的】棉花是一種異源四倍體作物，基因組結構復雜，常異花授粉的繁殖方式也導致棉花品種難以實現高度純合；棉種市場缺乏有效的監管技術手段，品種多亂雜現象長期存在，嚴重影響纖維品質一致性。構建中國近20年棉花審定品種標準樣品的DNA指紋庫，探索棉花品種高通量SSR身份鑒定模式，為棉花品種真實性鑒定和新品種特異性鑒定提供依據；分析審定品種的遺傳多樣性和群體分化，為棉花不同生態區的適應性鑒定和培育適應新環境的品種提供理論基礎?！痉椒ā炕诙嘀豍CR技術和毛細管電泳檢測方法，使用篩選得到的60個SSR標記構建1 015份棉花審定品種標準樣品的DNA指紋庫，通過植物品種DNA指紋庫管理系統對審定品種SSR指紋進行兩兩比對，分析審定品種的遺傳差異，篩選用于品種鑒定的核心SSR位點。利用聚類分析法和群體結構分析法分析1 015份棉花審定品種的遺傳多樣性，并計算群體間遺傳分化指數。【結果】60個SSR標記在1 015個審定品種中共擴增出216種等位變異，平均等位變異數為3.6，平均值為0.37。1 015個審定品種的SSR指紋進行兩兩比較，共產生513 591組結果，樣品間最大差異位點數為58個。差異位點百分比主要集中在41%—70%，涉及428 115組，占83.36%；其中，差異位點百分比在51%—60%時，涉及組數最多，為197 829組，占38.52%。品種間差異位點百分比大于20%時，占所有品種兩兩比對組數的99%以上，差異位點百分比低于20%的比對結果只占0.58%?；诮M合鑒定法，篩選一套包含10個SSR位點的核心位點組合，在1 015個品種中鑒別能力達到99%。聚類結果和群體結構分析表明，1 015個品種被清晰地劃分為5個亞群，G1（n=240）為早熟棉亞群，主要分布于中國北部和西北內陸地區，該亞群品種遺傳多樣性最豐富，品種間平均遺傳距離為0.419。G2（n=277）亞群為中熟棉亞群，分布于長江流域，該亞群雜交種較多，亞群內平均遺傳距離為0.309。G3（n=109）亞群屬于早熟、中熟棉亞群，分布于河北黑龍港地區，該亞群品種遺傳組分相對單一，亞群內平均遺傳距離在陸地棉群體中最小，僅為0.150。G4（n=254）亞群屬于中早熟棉亞群，主要分布于黃河流域，群體內平均遺傳距離為0.307。G5（n=37）亞群由37份海島棉組成，群體內平均遺傳距離最小，為0.149。海島棉與陸地棉之間遺傳分化水平最高，平均ST值為0.503；陸地棉群體內，G3亞群與其他亞群之間遺傳分化水平最高，ST值為0.193—0.242。長江流域與黃河流域相比，遺傳分化水平最低，ST值為0.112?！窘Y論】構建了1 015個中國近20年審定品種標準樣品DNA指紋庫，篩選了一套包含10個SSR位點的核心標記組合，可以清晰地鑒別99%以上的品種，創建了“核心位點+擴展位點”的高通量棉花鑒定模式；1 015個品種被劃分為5個亞群，其中，陸地棉具有明顯的地理分布特征。

棉花；標準樣品；SSR標記；DNA指紋庫；綜合評價

0 引言

【研究意義】我國是世界上主要植棉大國，植棉歷史悠久、地域遼闊。近年來，棉花審定品種的數量逐年增多。截至目前，我國通過國家審定和各省、自治區審定的棉花品種數量達到2 342個（中國種業大數據平臺，http://202.127.42.47）。隨著棉花品種遺傳基礎日趨狹窄和骨干親本的集中使用，導致出現了一系列派生品種、近似品種、姐妹系。種子市場上不斷出現“一名多品”“一品多名”、名不符實的現象，嚴重打擊了育種者的積極性，侵害了農民的利益，給農業生產帶來不利影響。構建棉花審定品種標準DNA指紋庫有助于凈化棉種市場、打擊套牌侵權、激發種業創新，為品種審定、品種保護、市場監管提供技術支撐。標準化的DNA指紋圖譜可以為司法仲裁提供客觀的依據。當涉及品種權益、品種保護或品種糾紛時，可以通過比對DNA指紋圖譜來確定品種的真實性和獨特性，確保知識產權的合法保護。研究棉花審定品種進行遺傳多樣性，可以明確現有品種的遺傳背景和系譜關系，有效指導常規育種的親本選擇及雜交組合選配，從而顯著提高傳統育種工作效率，支撐種業振興方案的實施，推動棉花產業高質量發展?！厩叭搜芯窟M展】根據農業行業標準，趙久然等[1]、王鳳格等[2-3]利用40對SSR核心引物構建了包含3 998個玉米審定品種標準樣品的DNA指紋庫；劉麗華等[4-6]、趙昌平等[7]利用21對SSR核心引物構建了560個小麥區域試驗品系的DNA指紋庫，以及使用42對SSR引物構建了75個小麥品種的DNA指紋庫；林亦霞等[8]利用農業行業標準NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術規程SSR標記法》[9]中48對SSR核心引物構建了94份雜交稻親本的DNA指紋庫。利用微衛星標記，程本義等[10]構建了279個浙江省水稻品種的DNA指紋圖譜數據庫。此外，馬鈴薯[11]、黃瓜[12]、大豆[13]、茄子[14]、辣椒[15-16]、花椰菜[17]等多種農作物均開展了DNA指紋庫構建工作。隨著棉花基因組測序工作的相繼完成[18-20]，棉花品種DNA指紋庫構建和遺傳多樣性研究的報道也越來越多?？锩偷萚21]利用36對SSR引物構建了32份棉花主栽品種DNA指紋庫；WANG等[22]利用40對SSR引物構建了1 242份棉花DUS測試樣品的DNA指紋庫。CHEN等[23]利用398對SSR引物，對不同親本來源、不同選育時期、不同種植生態區的43份陸地棉基礎種質進行了遺傳多樣性分析；賈子昉等[24]利用38對SSR引物分析了300份棉花種質資源的遺傳背景；郭志軍等[25]采用74個SSR標記對172份陸地棉自然群體的基因組變異進行掃描。HE等[26]利用10 522個高質量SNP位點分析了137個棉花登記品種的遺傳多樣性和群體結構；Hinze等[27]利用63K SNP芯片對395份棉花種質材料進行遺傳分析?！颈狙芯壳腥朦c】以往的研究對象往往是棉花核心種質[27-28]、育種材料[29-30]或自然群體[25]，很少涉及大量棉花審定品種標準樣品；構建的棉花DNA指紋庫規模較小，主要用于科學研究；構建指紋庫所使用的標記和建庫方法不標準，無法用于品種管理、市場監管、執法和司法仲裁?！緮M解決的關鍵問題】本研究根據行業標準《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》（NY/T 2634—2022）[31]，使用60個SSR標記對來自官方登記備案的1 015份棉花審定品種標準樣品進行了棉花標準DNA指紋庫構建，從分子水平上揭示了審定品種的遺傳多樣性和群體分化，篩選了一套包含10個SSR位點的核心標記組合，創建了“核心位點+擴增位點”的高通量棉花鑒定模式，為棉花品種管理、執法監督和培育新品種提供基礎，同時，也為建立公平的品種市場競爭環境提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1 015份材料包括617份常規種和398份雜交種（附表1），品種由1996至2019年國家或各省、自治區審定，基本涵蓋了中國曾經或正在推廣的棉花品種。所有樣品經農業農村部種業管理司批準，由中國種質資源庫（北京，中國）提供，系國家和省級農作物品種審定委員會向品種選育單位收集的中國棉花審定品種標準樣品。

1.2 SSR引物

60對SSR引物來自農業行業標準《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》（NY/T 2634—2022）[31]，所用SSR引物由美國Thermofisher公司合成，每對SSR引物中，選擇在上游引物5′端使用一種熒光染料進行標記，共選用了PET、NED、VIC、FAM 4種熒光染料，引物序列和熒光標記信息見附表2。

1.3 DNA提取

每份供試樣品隨機抽取70粒種子形成混合樣品，充分磨碎后，取100—200 mg粉末于2.0 mL離心管，采用匡猛等[32]棉花種子DNA快速提取法提取棉花基因組DNA。采用酶標儀（EPOCH）進行DNA質量和濃度的測定，并使用超純水稀釋成40 ng·μl-1的DNA工作液。

1.4 SSR指紋圖譜構建

采用農業行業標準《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》（NY/T 2634—2022）[31]，分別使用60對SSR引物對1 015份棉花審定品種標準樣品進行擴增。PCR擴增體系20 μL，包括10 μL 2×Taq Plus Master Mix（諾唯贊）、0.2 μmol·l-1SSR引物和120 ng DNA模板。PCR反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，32個循環；72 ℃ 7 min。

按照攜帶不同熒光標記的引物毛細管電泳時可以自由組合，攜帶相同熒光標記的引物，PCR擴增產物大小不同時毛細管電泳可以自由組合的原則，60個SSR標記組成6個十重毛細管電泳組合（表1），等體積取同一組合中10對引物的擴增產物，充分混勻。從混合液中吸取1 μL，加入DNA分析儀專用96孔上樣板上。每孔再分別加入0.15 μL Liz-500分子量內標和8.85 μL去離子甲酰胺，95 ℃ 5 min，4 ℃冷卻10 min以上，于ABI 3130xl基因分析儀（賽默飛公司）上進行電泳檢測。熒光毛細管電泳檢測程序為預電泳15 kV 3 min；2 kV進樣2 s；電泳15 kV 20 min。

毛細管電泳結果采用植物品種DNA指紋管理系統（以下簡稱指紋庫管理系統，登記號：2015SR085905）進行讀取、儲存與分析比對。

表1 多重引物組合信息

1.5 遺傳多樣性、群體結構和遺傳分化

采用Power marker V3.25軟件[33]分析SSR分子標記的等位基因數、雜合率、遺傳多樣性和多態性信息量（polymorphism information content，）等。采用類平均法（unweighted pair-group methodwith arithmetic means，UPGMA）對相似系數矩陣和遺傳距離矩陣進行聚類分析。使用Structure 2.3.4軟件[34]評估1 015份棉花審定品種的群體結構，基于數學模型劃分類群。設定亞群數K為1—10，每個K值運行10次，參數Length of burn-in period設為1.0×104次，MCMC（markov chain monte carlo）設為1.0×105次；根據似然值最大原則，并結合Evanno等[35]的統計模型，確定最佳K值。使用VCFtools（v.4.0）軟件分析群體間遺傳差異[36]，分別計算每個群體與其他群體在每個SSR位點的ST值。

2 結果

2.1 SSR標記多態性評估

根據1 015個審定品種的標準DNA指紋數據，對60個SSR標記的總體多態性情況進行全面評估，對等位基因數、基因型數、遺傳多樣性、雜交種中引物雜合率、值和主要等位基因及頻率多個參數進行分析（表2）。60個SSR引物總體多態性較高，共檢測到216種等位變異（附表3），平均等位變異數為3.6。其中，PC29引物的等位變異最豐富，有10種等位基因，27種基因型，說明該引物最適合揭示該群體的遺傳多樣性。引物的值與等位基因數、遺傳多樣性、雜交種中雜合率基本呈正相關，值越高，等位基因數、遺傳多樣性等指標也越高。這套核心引物是使用代表中國棉花種質資源庫7 362份棉花樣品的419份核心種質篩選而來。棉花審定品種大規模建庫數據，對引物的評估結果與以往的篩選評估結果基本一致[37]。

2.2 1 015個審定品種SSR指紋分析

將1 015個棉花審定品種標準SSR指紋上傳植物品種DNA指紋管理系統（登記號：2015SR085905），常規種在每個SSR標記中只擴增出單條帶，毛細管電泳對應峰型為單峰（常規種中棉所64號SSR指紋圖譜見附圖1），雜交種在SSR標記中可能擴增出單條帶或2條帶，毛細管電泳對應峰型為單峰或雙峰（雜交種中棉所72號SSR指紋圖譜見附圖2）。所有品種的SSR指紋進行兩兩比對，共產生513 591組比對結果。其中，新海38號與川雜棉10號、新海25與華雜棉H11兩組品種間差異位點數最大，為58個；所有海島棉與陸地棉相比，差異位點均大于34個。差異位點百分比主要集中在41%—70%，涉及428 115組，占83.36%；其中，差異位點百分比在51%—60%時，涉及組數最多，為197 829組，占38.52%。品種間差異位點百分比大于20%時，占所有品種兩兩比對組數的99%以上；差異位點百分比低于20%的比對結果只占0.58%（表3）。

表2 60個SSR引物擴增效果

續表2 Continued table 2

以等位變異擴增片段大小代表變異類型The allele amplification fragment size represents the variant type

在品種鑒定中，2個樣品差異位點百分比低于5%（小于3個差異位點），需要考慮2個樣品是近似品種或相同品種。1 015個樣品比對結果中差異位點在0—2共涉及152組，162個樣品，其中41組（58個樣品）比對結果顯示，2個樣品之間差異位點為0。該58份樣品已經提交審定標準樣品管理機構，正在進一步核實是否來自同一品種，如果來自同一品種，應在標準樣品庫中將指紋相同的樣品保留一份，其他進行合并或清理，如果來自不同品種，應進一步提供其他差異。

2.3 核心SSR位點組合的篩選

基于1 015個樣品60個SSR位點的基因型數據，按照引物值從高到低的順序，使用植物品種DNA指紋管理系統分析，當選擇表1中值最高的前5個引物PC29、PC12、PC15、PC13和PC03鑒定1 015個樣品時，差異位點數在0—2的有46 446組，占9%。當選擇表1中值最高的前10個引物鑒定1 015個樣品時，差異位點數在0—2的有4 557組，占0.9%。當選擇表1中值最高的前15個引物鑒定1 015個樣品時，差異位點數在0—2的有1 353組，占0.26%。以此類推，每次增加5個引物，1 015個樣品之間兩兩比對，差異位點在0—2的組數不斷較少，其中，大于10個SSR位點時，不能鑒別的組數趨于平緩（圖1）。因此，選擇最高的前10個SSR引物PC29、PC12、PC15、PC13、PC03、PC17、PC21、PC01、PC06和PC07作為核心引物首先用于品種鑒定，其鑒別能力為99.1%。

表3 棉花審定品種遺傳差異分析

圖1 SSR位點組合對1 015個樣品的鑒別能力

根據多重毛細管電泳組合原則，攜帶相同熒光基團的引物，擴增的等位變異片段不能重合；攜帶不同熒光基團的引物，擴增的等位變異片段可以重合。分析10個核心SSR引物攜帶熒光基團類型和擴增的等位變異片段大小，10個核心SSR引物可以組成一個十重毛細管電泳組合進行電泳。當10個核心引物組合不能區分樣品時，增加剩余的50個擴展引物進行鑒定。

2.4 群體結構和聚類分析

使用Structure 2.3.4軟件對1 015個標準樣品進行群體結構分析，Ln(P(D))值隨假定亞群數K值的增大而持續增大（圖2-a），ΔK峰值出現在K為5時（圖2-b），由此判定，該群體可被分為5個亞群（G1—G5）（圖2-c）。分析各供試樣品的Q值（某樣品其基因組變異源于第K群體的概率），結果表明，917份樣品（占90.3%）在某一亞群內Q值大于或等于0.5，說明這些樣品遺傳組分相對單一，可以明確劃分到5個亞群內；98份樣品（占9.7%）在任一亞群內Q值小于0.5，表明這些樣品遺傳組分比較復雜，無法明確歸類，單獨劃為一個混合群H。采用基于Nei（1973）遺傳距離的非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析（圖2-d），結果與群體結構分析基本一致。1 015個棉花品種被清晰地劃為4個陸地棉亞群和1個海島棉亞群，不同亞群內的品種表現出明顯的地理分布特征（表4）。

G1（n=240）亞群屬于特早熟、早熟棉亞群，主要分布于中國北部和西北內陸地區，包括遼寧南部、新疆大部和甘肅河西走廊一帶；品種主要以早熟的遼棉系列、酒棉系列、新陸早系列等棉花品種為主。該亞群材料間平均遺傳距離最大，為0.419，說明此亞群遺傳基礎比較復雜，表現出較高的遺傳多樣性。G2（n=277）亞群屬于中熟棉亞群，主要分布于長江流域，包括長江上游四川盆地丘陵地帶、長江中游沿江地區、長江中游丘陵地區、長江下游和南襄盆地。品種主要包含川棉、鄂棉、湘棉、皖棉和贛棉等。G2亞群雜交種較多，共191份，占該亞群的69%，群體內平均遺傳距離為0.309。G3（n=109）亞群屬于早熟、中早熟棉亞群，主要分布于河北省黑龍港地區，包括滄州、衡水、邢臺等地；品種主要包括冀棉、國欣棉、津棉等。品種遺傳組分相對單一，亞群內平均遺傳距離在陸地棉群體中最小，僅為0.150。G4（n=254）亞群屬于中早熟棉亞群，主要分布于黃河流域，包括華北平原和黃淮平原地區。品種以魯棉、豫棉、中棉所系列等為主，群體內平均遺傳距離為0.307。G5（n=37）亞群由37份海島棉組成，群體內平均遺傳距離最小，為0.149。

表4 1 015個樣品群體結構分析中亞群信息

a：Ln(P(D))與K值變化折線圖；b：利用ΔK估算亞群數目；c：K=5時的群體結構圖；d：1 015個棉花品種聚類圖

2.5 群體間的遺傳分化

進一步對群體間的分化程度分析，使用VCFtools（v.4.0）軟件分別計算每個群體與其他群體在每個等位變異位點的ST值，成對比較亞群間的平均ST值（圖3）。與陸地棉亞群相比，海島棉群體間遺傳分化最大，ST值為0.431—0.563。陸地棉亞群間遺傳分化較小，ST值為0.112—0.242，其中，來自河北黑龍港地區的G3亞群與長江流域的G2亞群之間遺傳分化指數最大，為0.242，這與G3亞群的品種在地理分布上比較聚集，平均種植緯度相對較高，而G2亞群的品種平均種植緯度最低有關。G3亞群與G1（中國北部和西北內陸）和G4（黃河流域）亞群相比，ST值相對較高，分別為0.198和0.193。G2（長江流域）與G4（黃河流域）相比，遺傳分化最低，ST值為0.112；G2（長江流域）與G1（中國北部和西北內陸）相比，ST值為0.129；G1（中國北部和西北內陸）與G4（黃河流域）相比，ST值相對較低，為0.124。G1、G2和G4之間兩兩比較，ST值都較低，原因可能是長江流域亞群中雜交種較多，親本中可能含有來自黃河流域或西北內陸的材料，遠緣雜交提高品種的雜種優勢；G1亞群南疆地區與黃河流域緯度相似，品種在生態適應性上差異較小，兩地區可以相互引種，所以遺傳分化較小。

圖3 成對比較亞群間的平均FST值

3 討論

3.1 SSR標記篩選

《中華人民共和國種子法》規定申請審定和新品種保護的品種應當符合特異性、穩定性、一致性的要求（DUS測試）。隨著棉花骨干親本的集中使用和棉花品種數量的迅速增加，DUS測試和品種管理面臨諸多挑戰，如周期長，一般要經過2—3年的重復觀察；受季節限制，也易受自然災害、病蟲害等因素的影響；測試性狀多，工作量大，人工成本高；測試性狀多數為多基因控制的數量性狀，受環境等因素影響較大，表現為連續變異，使性狀分級不明顯。分子標記在品種鑒定方面具有許多優勢，包括共顯性、高效性以及不受環境影響。目前，國內外公認的農作物DNA指紋鑒定技術主要是SSR標記技術[2, 5-6, 8]和SNP標記技術[38-41]。其中，SSR標記具有多態性高、共顯性遺傳、穩定性好的優點，并且SSR檢測操作簡便、對試驗條件要求不高、檢測成本低，便于在實驗室開展工作，被國際植物新品種保護聯盟（International Union for The Protection of New Varieties of Plants，UPOV）推薦為農作物品種鑒定優選標記[42]。我國建立了玉米[3]、小麥[7]、水稻[9]、向日葵[43]等15種作物SSR標記鑒定技術的農業行業標準，其中，《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》（NY/T 2634—2022）[31]于2023年3月1日實施。相比遺傳多樣性分析和遺傳定位研究，由于品種鑒定主要用于品種管理、市場監督和司法仲裁，因此更看重SSR標記的穩定性、重復性、擴增效率和易于判讀的特性。本研究使用60個SSR標記以棉花全基因組測序數據為基礎，以48份棉花基礎種質10×重測序數據為來源，使用代表7 362份棉花材料的近400份棉花核心種質作為篩選材料[44]，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳初篩和毛細管電泳復篩，自主開發的在基因組上具有單拷貝特性的引物，實現了四倍體作物二倍化分型，即常規種在60個SSR位點全部為單條帶的純合型，雜交種在60個SSR位點中會出現單條帶的純合型或2條帶的雜合型，大大降低了數據統計與分析的難度[37]。

3.2 棉花品種真實性鑒定

品種真實性是種子的主要質量指標，影響作物的產量和品質。劉峰等[45]利用來自Cotton Marker Database（CMD）數據庫中的11對首選核心SSR引物對25個區試樣品和32個審定品種進行真實性鑒定，通過遺傳相似系數判定，在遺傳相似系數為0.984時，參試品系被分為53系?？锩偷萚46]利用36對SSR核心引物對138個棉花主栽品種進行指紋庫構建，每個品種檢測6個單粒種子DNA，并將3個差異位點作為判定閾值。王欣怡等[47]利用26對SSR引物對10份棉花常規種進行真實性鑒定，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法，每個樣品檢測15個單株。以往對棉花品種真實性鑒定的研究中，樣品量太少，無法評估SSR標記對大批量樣品的鑒別能力；每個樣品檢測多個單株的DNA，工作量大，而且選擇的單株太少，統計學上沒有代表性；檢測方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳，不同批次，不同電泳板的結果無法比對。

本研究使用的60個SSR標記來自《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》（NY/T 2634—2022）[31]，標記的鑒別能力經過大量樣品的驗證，標記的檢測效果經過多家單位驗證。本文首次使用標準方法為1 015個棉花標準樣品建立了標準DNA指紋，每個樣品使用70?；鞓拥腄NA，可以代表樣品的真實基因型；使用熒光毛細管電泳法，指紋數據上傳到植物品種DNA指紋管理系統中（登記號：2015SR085905），可以隨時進行比對。基于組合優化算法，篩選了一套具有10個SSR位點的核心標記組合，使用最少的SSR標記可以有效區分99%以上的棉花品種，用于棉花品種的高通量鑒定。在實際品種鑒定過程中首先使用含較少標記的核心組合對大量樣本進行篩查，有效區分大多數品種；對于無法區分的樣品，繼續使用剩下的標記進行比對?！昂诵奈稽c+擴展位點”分步鑒定的方法在極大提高檢測通量的同時有效節約了成本，對于確保棉花品種的真實性、品種審定以及未來植物新品種的保護具有重要意義。

3.3 遺傳多樣性分析

在不同的生態環境（如年平均降水量、日照、太陽輻射和溫度）下，品種產生趨異適應，成為遺傳上有差異的、適應不同生態環境的類群，被稱為品種的“生態型”[26]。近年來，我國植棉地區發生了很大的變化，棉區遷移加劇了研究陸地棉生態適應性的緊迫性，如何快速育成適應特定棉區的品種，是棉區變遷中亟需解決的問題。而親本材料是育種工作的基礎，對育種材料進行類群劃分，明確育種基礎材料遺傳多樣性、遺傳背景及遺傳結構，對選育新品種具有非常重要的作用。在棉花研究中利用SNP技術[26, 30, 44]對不同生態型進行類群劃分已有報道。然而，SNP技術具有成本高、對試驗條件要求高，不易操作等缺點。本文構建的1 015份棉花審定品種標準樣品DNA指紋數據庫首次揭示了中國近20年棉花審定品種的遺傳多樣性和群體結構，聚類分析和群體結構分析基本一致，1 015個棉花審定品種被清晰地劃為5個生態亞群，這與前人[26, 30]的研究結果基本一致。4個陸地棉群體具有明顯的地理分布特征，其中，西北內陸地區的棉花遺傳多樣性最豐富，長江流域的品種遺傳多樣性大于黃河流域，河北黑龍港地區的品種遺傳多樣性最小，研究結果與郭志軍等[25]、別墅等[48]、劉文欣等[49]的研究結論基本相似。近20年審定品種的遺傳多樣性低于棉花基礎種質[23]和自然群體[25]，說明在品種選育過程中由于追求產量和品質，拋棄了許多遺傳變異，使棉花品種的遺傳多樣性進一步降低。在今后的育種工作中，可以更有針對性地對材料加以選擇和利用，選擇親本時，除考慮材料間的親緣關系外，還要考慮其復雜的遺傳組分，盡可能挑選親緣關系相對較遠，遺傳背景不同的材料作為父母本，不僅能夠避免盲目組配，而且省時省力，加快育種進程，獲得可預見性的優勢品種。

4 結論

構建了1 015份棉花審定品種標準樣品的DNA指紋數據庫，并將其分為5個亞群：中國北部和西北內陸亞群、河北黑龍港亞群、黃河流域亞群、長江流域亞群和海島棉亞群。篩選了一套包含10個SSR位點的核心標記組合，創建了棉花品種“核心位點+擴展位點”的高通量棉花鑒定模式。

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WU YuZhen1,2, HUANG LongYu1,2, ZHOU DaYun1,2, HUANG YiWen1,2, FU ShouYang1,2, PENG Jun1,2, KUANG Meng1,2

1Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 450001, Henan;2National Nanfan Research Institute (Sanya), Chinese Academy of Agricultural Sciences, Sanya 572024, Hainan

【Objective】Cotton, a heterotetraploid crop with a complex genome structure, faces challenges in achieving high homozygosity due to frequent cross-pollination. The absence of effective technical supervision in the cotton seed market and the persistence of disordered varieties have a negative impact on the consistency of fiber quality. The objectives of this study are threefold: to establish a DNA fingerprint database for approved cotton varieties in China over the past 20 years, to explore a high-throughput SSR identification model for cotton varieties, and to provide a basis for the authentication of existing varieties and the specific identification of new cotton varieties. Additionally, we aim to analyze the genetic diversity and population differentiation among approved varieties. Ultimately, our goal is to provide a theoretical framework for identifying cotton varieties that are well-suited to different ecological regions and for developing varieties that can adapt to new environments.【Method】Based on multiplex PCR technology and capillary electrophoresis detection method, using 60 SSR markers screened to construct a DNA fingerprint library of 1 015 standard samples of cotton approved varieties. Through the plant variety DNA fingerprint library management system, the SSR fingerprints of approved varieties were compared pairwise to analyze the genetic differences of approved varieties and screen the core SSR loci for variety identification. Cluster analysis and population structure analysis were used to analyze the genetic diversity of 1 015 cotton approved varieties and calculate the genetic differentiation index between populations.【Result】60 SSR markers amplified 216 allelic variations in 1 015 approved varieties, with an average of 3.6 allelic variations and a meanvalue of 0.37. When the SSR fingerprints of the 1 015 approved varieties were compared, a total of 513 591 pairwise results were generated, with a maximum of 58 different loci between samples. The percentage of different loci was mainly concentrated at 41%-70%, involving 428 115 groups, accounting for 83.36%. Among them, when the percentage of different loci was at 51%-60%, the largest number of groups was involved, accounting for 197 829 groups, accounting for 38.52%. When the percentage of different loci between varieties was greater than 20%, it accounted for more than 99% of all pairwise comparison groups, and the pairwise comparison results with a percentage of different loci lower than 20% only accounted for 0.58%. Based on the combination identification method, a set of cores SSR loci containing 10 SSR loci was selected, and the discrimination ability among the 1 015 varieties reached 99%. Clustering results and population structure analysis showed that the 1 015 varieties were clearly divided into five subpopulations. G1 (n=240) was an early-maturing cotton subpopulation, mainly distributed in northern and inland regions of China. This subpopulation had the most abundant genetic diversity among varieties, with an average genetic distance of 0.419 between varieties. G2 (n=277) was a medium-maturing cotton subpopulation, distributed in the Yangtze River Basin. This subpopulation had more hybrids, with an average genetic distance of 0.309 within the subpopulation. G3 (n=109) belonged to early-maturing and medium-maturing cotton subpopulations, distributed in Hebei'sHeilonggang region. This subpopulation had relatively simple genetic components, with the smallest average genetic distance among upland cotton subpopulations at only 0.150. G4 (n=254) belonged to a medium-early maturing cotton subpopulation, mainly distributed in the Yellow River Basin. The average genetic distance within this subpopulation was 0.307. G5 (n=37) consisted of 37 sea island cotton samples, with the smallest average genetic distance within the population at only 0.149. The genetic differentiation level between sea island cotton and upland cotton was the highest, with an averageSTvalue of 0.503. Among upland cotton populations, the genetic differentiation level between G3 and other subpopulations was the highest, withSTvalues ranging from 0.193 to 0.242. The genetic differentiation level between the Yangtze River Basin and the Yellow River Basin was the lowest, with anSTvalue of 0.112.【Conclusion】A DNA fingerprint library of standard samples of 1 015 approved varieties in China over the past 20 years was constructed. A set of cores SSR loci containing 10 SSR loci was selected to clearly identify more than 99% of the varieties. A high-throughput cotton identification model of "core loci + extended loci" was created. The 1 015 varieties were divided into five subpopulations, and upland cotton had obvious geographical distribution characteristics.

cotton; standard samples; SSR markers; DNA fingerprint database; comprehensive evaluation

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.002

2023-11-09；

2024-01-08

三亞崖州灣科技城科技專項（SCKJ-JYRC-2022-62）、棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室項目（CB2022C08）、農業生物育種重大項目（2022ZD04019）、海南省自然科學基金聯合項目（SQ2021ZRLH0113）

吳玉珍，Tel：13629838042；E-mail：15959263920@163.com。通信作者彭軍，Tel：13937228796；E-mail：jun_peng@126.com。通信作者匡猛，Tel：15836313471；E-mail：kuangmeng007@163.com

（責任編輯 李莉）