曬田環境脅迫對克氏原螯蝦卵巢組織、卵黃蛋白原及營養物質代謝的影響

袁 暢,李 蔚,黃玉英,何蘋萍,鄭玉斯,李 鑫,盧智發,張圣杰,李文紅 , 彭金霞,王大鵬

(1.廣西水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室,南寧 530021;2.廣西大學動物科學技術學院,南寧 530004)

【研究意義】克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又稱小龍蝦,原產于北美洲,最早于1929年由日本傳入中國南京,已成為重要養殖經濟蝦類[1],但目前面臨苗種繁育能力低、品質退化、提質增效空間受限等問題[2]。曬田通過環境脅迫影響生物生長、繁殖、儲存等活動的能量最佳分配[3],近年來在生產上使用較多,但目前該技術尚未標準化,曬田起始時間和曬田時長主要依靠生產經驗。因此,了解曬田環境脅迫后的克氏原螯蝦卵巢組織學特點與體內營養相關調節機制,可為生產操作的改進提供參考依據?！厩叭搜芯窟M展】目前對于克氏原螯蝦卵巢發育階段的研究較多,根據顏色和組織學特點,國內學者主要將卵巢發育分為7個(未發育期、發育早期、卵黃發生前期、卵黃發生期、成熟期、產卵后期和恢復期)[4]、6個(I期、II期、III期、IV期、V期和VI期)[5]、5個(卵黃發生前期、卵黃發生初期、卵黃發生中期、成熟期和產后恢復期)[6]或4個(卵黃發生前階段、早期卵黃發生階段、中期卵黃發生階段和成熟階段)[1]階段。卵黃積累是甲殼類動物卵母細胞發育成熟的必要前提,促使卵巢產生變化,進入下一個發育階段[7]。卵黃發生可為卵母細胞生長及胚胎發育供給所需的氨基酸、脂、鈣和能量等營養和功能性物質,對生殖至關重要[8]。蝦蟹類動物胚胎以及開口前仔體都屬于卵黃營養,作為卵黃主要成分,卵黃蛋白對維持早期蝦類生命具有關鍵作用[9]。卵黃蛋白原是卵黃蛋白主要成分卵黃磷蛋白的前體,對于卵母細胞發育成熟具有重要意義[10]。不同環境脅迫下甲殼動物體內卵黃蛋白原濃度或mRNA水平存在差異。在鹽度脅迫脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)中,卵黃蛋白原濃度隨著鹽度升高呈先上升后下降趨勢[11];在農藥阿特拉津脅迫克氏原螯蝦中,卵黃蛋白原濃度及mRNA水平隨阿特拉津濃度升高而下降[12];在重金屬鎘脅迫淡水蟹(Sinopotamonhenanense)中,卵黃蛋白原濃度及mRNA水平隨鎘濃度增加而下降[13];在4-壬基酚脅迫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和螃蟹(Carcinusaestuarii)中,卵黃蛋白原濃度隨著4-壬基酚濃度增加而上升[14]。卵黃蛋白原被稱為卵巢發育的生物學標準物,但評價卵巢發育僅卵黃蛋白原這一個指標并不充分。營養代謝水平與卵巢發育相輔相成,也是評價水產動物生長與繁殖的重要指標,受環境脅迫影響會發生相應變化。如高溫脅迫下,三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)血藍蛋白(Hem)含量低于低溫脅迫[15];凡納濱對蝦(LitopenaeusVannamei)在急冷與空氣暴露聯合脅迫下,隨著脅迫時間延長,乳酸(LA)和葡萄糖(Glu)均呈先上升后下降趨勢[16]。【本研究切入點】已有研究表明曬田環境脅迫可促熟克氏原螯蝦卵巢[17],但曬田脅迫期間的卵巢組織學特點及促使卵巢發育的卵黃蛋白原和營養物質代謝相關情況尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】對比分析克氏原螯蝦在曬田環境脅迫期間的卵巢組織學特征、卵黃蛋白原和營養物質代謝的變化過程,進一步探索其變化機制,為曬田環境脅迫促進克氏原螯蝦卵巢成熟這一生產操作的改良和標準化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試克氏原螯蝦采自廣西來賓市興賓區的一個稻蝦養殖場。試驗使用2個池塘,即曬田池塘和對照池塘。曬田池塘將池塘田面(300 m2)用塑料圍子和鐵管圍牢,防止逃逸,池內所有試驗蝦為曬田組。對照池塘不需要改造,池內所有試驗蝦為對照組。曬田池塘中克氏原螯蝦為穴居,在曬田脅迫開始1～2 d內掘穴,用刨出的泥土將洞口封住,在洞內晝夜棲居。對照池塘中克氏原螯蝦白天在環溝底部隨機爬行或隱蔽,光照條件適宜時覓食。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 于2022年9月將2個池塘田面上水30～40 cm,分別選取50 kg克氏原螯蝦投至2個池塘田面,持續1周,正常養殖投喂?？耸显r雌雄比1∶1;2個池塘中隨機挑選30只蝦進行測量與解剖,曬田池塘中克氏原螯蝦平均規格為(24.61±6.36)g,對照池塘中克氏原螯蝦平均規格為(23.56±5.67)g,二者規格接近。雌性克氏原螯蝦卵巢I期、II期、III期、IV期均有發現。正式試驗開始后,將曬田池塘的田面水排干,使田面自然曝曬,促使雌性克氏原螯蝦在田面掘穴并封口,正式試驗開始后停止投喂;對照池塘正常養殖,每天繼續投喂適量人工配合飼料。

1.2.2 樣品采集 曬田脅迫0、3、7、10 d時分別從2個池塘隨機采集30只雌性克氏原螯蝦,曬田池塘于采集當天在田面使用鐵鏟挖掘蝦洞,將蝦鉗探入洞中捕捉采集,對照池塘于采集前一天在環溝中放置多個蝦籠,定時收籠起捕。將每個時間段的30只雌性克氏原螯蝦解剖,記錄卵巢顏色并拍照。曬田池塘與對照池塘每個時間段隨機取10只雌性克氏原螯蝦卵巢,制作石蠟切片及HE染色,分析其卵巢組織學特點并計算卵巢成熟率(卵巢生長至IV期鑒定為卵巢成熟)。在曬田組與對照組中,每個采樣時間段隨機取5只蝦的組織作為一個混樣,并設置3個平行。將雌性克氏原螯蝦置于冰上,取出其肝胰腺和卵巢分別放入凍存管,所有組織均置于液氮保存備用。從5只雌性克氏原螯蝦的圍心腔各取1 mL血淋巴放入抗凝管,將其進行混合,于4 ℃冰箱靜置20 min,4 ℃下2500 r/min離心10 min,取其上清液分裝至離心管,得到血清。進一步檢測卵巢、肝胰腺和血清的卵黃蛋白原濃度及卵巢和肝胰腺mRNA表達水平,并檢測血清營養物質代謝水平。

卵巢成熟率(%)=IV期卵巢數量/總卵巢數量×100

組織表達量=該時間段組織(卵巢或肝胰腺)的mRNA相對表達量×該時間段組織(卵巢或肝胰腺)的平均質量

組織表達總量=該組織的不同時間段組織表達量的總和

個體表達總量=不同組織的組織表達總量的總和

組織貢獻率=該組織的組織表達總量占個體表達總量的百分比

1.2.3 制作卵巢石蠟切片和HE染色 將各時間段采集的雌性克氏原螯蝦解剖,在各時間段雌性克氏原螯蝦中隨機采集10只蝦的卵巢,每個卵巢均利用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上,通過75%～95%梯度酒精以及無水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋以及切片等步驟制作組織切片,再脫蠟,使用蘇木素和伊紅進行HE染色及脫水封片,經顯微鏡鏡檢、測量和拍照。

1.2.4 卵黃蛋白原mRNA表達水平和濃度檢測 提取RNA:使用總RNA提取試劑盒(天根,DP419)從克氏原螯蝦卵巢和肝胰腺樣品中提取總RNA,測定樣品吸光度值(OD),通過260和280 nm的OD值確定RNA質量,再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定提取RNA的完整性和污染情況。RNA反轉錄:取200 ng 樣本RNA,添加RNase-free ddH2O至12 μL,加入3 μL 5×gDNA digester Mix,42 ℃孵育2 min,再加入5 μL 4×Hifair III SuperMix Plus,配出20 μL 反應體系上機(PCR程序設置:25 ℃ 5 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min),得到cDNA產物。

實時熒光定量檢測:取10 μL SYBR Premix ExTaq(2×),加入正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)各1 μL,加入1 μL模板(cDNA),再添加ddH2O至20 μL,配出20 μL反應體系上機,設置兩步法熒光定量PCR擴增條件(擴增曲線:95 ℃ 5 min,循環1次;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環40次,72℃單點檢測信號;熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60s,95 ℃ 15 s,連續檢測信號),下機得到CT值。每個樣品重復測定3次,采用2-△△Ct法對數據進行相對定量分析,獲得卵黃蛋白原mRNA相對表達量。使用18S基因作為內參基因,18S基因與卵黃蛋白原基因的引物序列如表1所示。

表1 試驗引物與序列Table 1 Experimental primers and sequences

卵黃蛋白原濃度采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA 試劑盒檢測,進行3次重復。

1.2.5 營養物質代謝水平檢測 Hem和總蛋白(TP)采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA試劑盒和BCA法蛋白含量試劑盒檢測。Glu采用高效液相法檢測。LA、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒檢測。以上每個指標檢測均進行3次重復。

1.3 統計分析

數據整理分析使用Excel 2019、SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件。

2 結果與分析

2.1 曬田環境脅迫下克氏原螯蝦卵巢組織學特點及成熟率變化

如圖1所示,根據形態和顏色,在曬田組與對照組雌性克氏原螯蝦中分別鑒定出4個卵巢發育階段,包括卵黃發生前階段(I期)、初級卵黃發生階段(II期)、次級卵黃發生階段(III期)、成熟階段(IV期)。I期卵巢為黃色,肉眼可觀察到細小顆粒,壁膜較厚(圖1-A);II期卵巢為橙色,外觀輪廓清楚,壁膜變薄,卵粒增大但不飽滿,排列緊湊(圖1-B);III期卵巢為棕色,體積明顯變大,且卵粒飽滿(圖1-C);IV期為黑褐色,體積再次膨脹,卵粒更加飽滿且易脫落(圖1-D)。HE染色結果表明,鑒定的4個雌性克氏原螯蝦卵巢發育階段準確性較高。I期卵母細胞小且接近圓形或橢圓形,直徑150～250 μm,細胞核與細胞質呈淡藍偏紫色(圖1-E);II期卵母細胞外形變化不大,直徑250～600 μm,出現卵黃顆粒,胞漿大部分為紫紅色,少許藍色(圖1-F);III期卵母細胞直徑大于600 μm,胞漿呈紫紅色且紅色程度增加,卵黃顆粒增加且體積變大(圖1-G);IV期卵母細胞直徑大于1000 μm,卵黃顆粒呈紫紅色且尺寸明顯增加,排列略微疏散(圖1-H)。如圖2所示,曬田脅迫0 d時,曬田組與對照組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率相似;曬田脅迫10 d時,曬田組的雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率上升至96.67%,而對照組僅上升至60.00%。

A～D:卵巢外部形態;A:I期;B:II期;C:III期;D:IV期。E～H:卵巢組織形態學HE染色;E:I期卵母細胞,F:II期卵母細胞,G:III期卵母細胞,H:IV期卵母細胞。A-D: External morphology of ovary; A: Phase I; B:Phase II; C:Phase III; D: Phase IV. E-H: Histomorphology HE staining of ovary; E: Phase I oocytes, F: Phase II oocytes, G: Phase III oocytes, H: Phase IV oocytes.圖1 克氏原螯蝦卵巢發育階段鑒定Fig.1 Identification of ovarian development stage of P. clarkii

2.2 曬田環境脅迫對克氏原螯蝦卵黃蛋白原mRNA表達水平和濃度的影響

如表2所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢中卵黃蛋白原mRNA相對表達量、卵巢質量、肝胰腺中卵黃蛋白原的mRNA相對表達量和肝胰腺質量與對照組均不存在顯著差異(P>0.05,下同)。隨著脅迫時間增加,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦不同組織中卵黃蛋白原的mRNA相對表達量均呈上升趨勢。如表3所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原的卵巢表達量與對照組均不存在顯著差異;曬田脅迫0和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達量與對照組不存在顯著差異;曬田脅迫3和7 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達量顯著大于對照組(P<0.05,下同)。曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達總量均大于卵巢表達總量,肝胰腺貢獻率均大于卵巢貢獻率,2組肝胰腺貢獻率均大于60.00%,卵巢貢獻率均大于25.00%,且曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢貢獻率低于對照組,肝胰腺貢獻率高于對照組。如圖3所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢、血液中卵黃蛋白原濃度與對照組不存在顯著差異;曬田脅迫0、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺中卵黃蛋白原濃度與對照組不存在顯著差異;曬田脅迫3 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺中卵黃蛋白原濃度顯著大于對照組。隨脅迫時間增加,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦卵巢、肝胰腺和血液中的卵黃蛋白原濃度均呈上升趨勢。如表4所示,Pearson相關系數表明,肝胰腺卵黃蛋白原濃度與卵巢卵黃蛋白原濃度、肝胰腺卵黃蛋白原濃度與血清卵黃蛋白原濃度、卵巢卵黃蛋白原濃度與血清卵黃蛋白原濃度間呈極顯著正相關(P<0.01,下同),相關系數分別為0.985、0.954和0.918。

表2 不同曬田時間克氏原螯蝦卵巢與肝胰腺質量以及該組織卵黃蛋白原的mRNA相對表達量Table 2 The mass of ovaries and hepatopancreas and the relative mRNA expression of vitellogenin in the tissues of P. clarkii at different sunning field time

折線上不同小寫字母表示同一曬田時間下不同處理組間差異顯著(P<0.05),下同。Different lowercase letters on the polyline indicate significant differences between treatment groups at the same time (P<0.05). The same as below.圖3 不同曬田時間克氏原螯蝦各組織卵黃蛋白原濃度變化Fig.3 Changes of vitellogenin concentration in different tissues of P. clarkii at different sunning field time

表3 不同曬田時間克氏原螯蝦卵黃蛋白原在卵巢和肝胰腺中的表達量及貢獻率Table 3 The expression and contribution rate of vitellogenin in the ovary and hepatopancreas of P. clarkii at different sunning field time

表4 曬田環境脅迫下克氏原螯蝦各組織卵黃蛋白原濃度的相關性Table 4 Correlation of vitellogenin concentrations in various tissues of P. clarkii under sunning field environmental stress

2.3 曬田環境脅迫對克氏原螯蝦營養物質代謝的影響

如圖4所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中的Hem和TP含量與對照組不存在顯著差異,隨著脅迫時間增加,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦血液中Hem和TP含量均呈下降趨勢,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中Hem和TP含量下降幅度大于對照組。曬田脅迫0和3 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中的TG含量與對照組不存在顯著差異;曬田脅迫7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TG含量顯著大于對照組。曬田脅迫0、3和7 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TC含量與對照組不存在顯著差異,曬田脅迫10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TC含量顯著大于對照組。隨著時間增加,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦血液中TG和TC含量呈上升趨勢,曬田組TG與TC含量上升幅度大于對照組。曬田脅迫0、3、7和10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中LA含量與對照組不存在顯著差異。曬田脅迫0、3和7 d時,2組雌性克氏原螯蝦血液中Glu含量不存在顯著差異;曬田脅迫10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中Glu含量顯著低于對照組。隨著脅迫時間增加,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦血液中LA和Glu含量呈下降趨勢,曬田組雌性克氏原螯蝦血液中LA和Glu含量下降幅度大于對照組。

圖4 不同曬田時間克氏原螯蝦營養物質代謝指標變化Fig.4 Changes of nutrient metabolism indexes of P. clarkii at different sunning field time

3 討 論

3.1 曬田環境脅迫對克氏原螯蝦卵巢發育分期及成熟率的影響

隨著卵母細胞增殖和卵黃及脂卵黃的攝取,克氏原螯蝦卵巢發育成熟,期間卵巢體積增大,顏色發生白色、黃色、棕色和深棕色的變化[1]。因此,根據形態和顏色可初步判斷克氏原螯蝦卵巢發育階段。在曬田脅迫期間發現4種不同顏色卵巢,分別為黃色的卵黃發生前階段(I)、橙色的初級卵黃發生階段(II)、棕色的次級卵黃發生階段(III)、黑褐色的成熟階段(IV),由黃色到黑褐色的變化過程中,卵巢體積不斷增大。本研究中曬田環境脅迫雌性克氏原螯蝦卵巢顏色與正常養殖下一致,但卻不同于Zhong等[1]正常養殖下的卵巢顏色,推測可能與地域環境條件有關。將采集的雌性克氏原螯蝦卵巢分為4個階段,與前人研究中的分期方法基本一致,而I～IV期卵母細胞直徑大小與其相應階段的細胞大小有所差異,可能與卵巢成熟時間和成熟方式有關[1,9,18]。

本研究中,曬田脅迫10 d時,對照組雌性克氏原螯蝦卵巢發育分期主要為III期和IV期,而曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢發育分期主要為IV期,表明正常養殖下卵巢從III期發育至IV期還需較長時間,而曬田環境脅迫僅需10 d即可將卵巢發育至IV期,大幅度提高卵巢發育成熟速度。曬田脅迫0 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率與對照組相似,曬田脅迫10 d時,曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率升至96.67%,但對照組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率僅升至60.00%。這也再次驗證了生產上曬田環境脅迫可提高克氏原螯蝦卵巢發育成熟速度的結論。本研究雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率結果與廣西水產科學研究院王大鵬科研團隊前期研究的曬田環境脅迫雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率結果(7.5%～92.5%)有所差異,但曬田脅迫10 d時雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率均在90%.00以上,推測是天氣狀況、暴曬情況及克氏原螯蝦種質優劣不同而導致雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率有所差異。

3.2 曬田環境脅迫對克氏原螯蝦卵黃蛋白原的影響

甲殼動物內分泌系統的性類固醇相關激素[19]、高血糖家族激素[20]、甲基法尼酯[21]以及蛻皮激素[22]都能影響卵黃蛋白原合成。本研究曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦卵巢與肝胰腺卵黃蛋白原mRNA相對表達量及卵巢、肝胰腺和血液卵黃蛋白原濃度均隨脅迫時間增加呈上升趨勢,表明曬田環境脅迫可影響內分泌系統相關激素分泌,使克氏原螯蝦體內不同組織卵黃蛋白原合成隨時間增加均得到不同程度提高。然而研究表明,隨著環境脅迫時間增加,機體的能量儲備消耗越發明顯[12],慢性脅迫可能導致水生無脊椎動物糖原、脂質和蛋白質作為最終能量被消耗[3],卵黃蛋白原作為成熟卵母細胞中主要蛋白質,將在慢性脅迫下發揮作用而被消耗[12],表現為濃度或mRNA水平降低。這與本研究結果存在差異,產生差異的原因推測為卵黃蛋白原在曬田環境脅迫下本身存在一定消耗,但消耗量遠遠低于合成量,因此在數據上表現為上升趨勢。此外,甲殼動物卵黃蛋白原外源性合成部位為肝胰腺,內源性合成部位為卵巢,血液僅具有運輸功能[23]。關于克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成部位的研究較少,相關報道顯示,克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成器官僅涉及肝胰腺和卵巢,主要合成器官為肝胰腺,其貢獻率在80%以上[9]。本研究曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原的肝胰腺表達總量均大于卵巢表達總量,肝胰腺貢獻率均大于卵巢貢獻率,2組肝胰腺貢獻率均大于60.00%,卵巢貢獻率均大于25.00%,說明曬田環境脅迫與正常養殖下雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成部位都以肝胰腺為主,卵巢為輔。然而曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢貢獻率低于對照組,肝胰腺貢獻率高于對照組,表明曬田環境脅迫可增加外源性卵黃蛋白原合成,降低內源性卵黃蛋白原合成。Pearson相關系數顯示,曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺卵黃蛋白原濃度與卵巢和血淋巴呈極顯著正相關,相關系數分別為0.985和0.954,表明曬田環境脅迫可促進克氏原螯蝦肝胰腺向卵巢轉運卵黃蛋白原。

3.3 曬田環境脅迫對克氏原螯蝦營養物質代謝指標的影響

克氏原螯蝦具有特殊習性,當生活環境發生巨大變化(如干旱、高溫酷暑等)時,其種族延續與繁殖需求將變成生存下首要選擇,繁殖性能將發生變化,因此體內營養能量將優先供給繁殖相關活動[24]。甲殼動物卵巢發育及能量代謝所必需的營養物質為糖類、脂質和蛋白[25]。TP和Hem可反映甲殼動物蛋白質代謝。TP在甲殼動物體液免疫過程中起關鍵作用,是重要能量來源[26]。Hem具有載氧、酚氧化物酶活性、轉運金屬離子、儲存蛋白質、滲透壓調節、蛻皮激素載體、表皮固化等作用[27-28]。甲殼動物將體內富余蛋白質以Hem形式儲存,作為存儲蛋白能量的有效途徑[29]。本研究曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦Hem和TP含量均隨脅迫時間延長呈下降趨勢,曬田組雌性克氏原螯蝦Hem和TP含量下降幅度大于對照組,表明與正常養殖相比,曬田環境脅迫下克氏原螯蝦體液免疫能力下降,機體對環境的防御反應能力降低,同時存儲蛋白能量的效率降低,體內富余蛋白質減少,且對滲透壓、蛻皮激素等生理指標的調控能力降低,推測是因為受惡劣環境影響,克氏原螯蝦體內能量儲備消耗較嚴重,同時供給繁殖相關活動能量較多。

TC和TG可反映甲殼動物脂質代謝。TC是甲殼動物體內性類固醇激素及多種激素合成的重要原料,可調控卵巢發育的重要營養與能量物質,對性腺發育等功能活動具有重要作用[30]。TG是甲殼動物生殖和代謝過程中重要的營養和能量來源,作為成體、卵和開口前幼體能量貯存的主要方式,對促進卵巢發育和繁殖具有關鍵作用[31-32]。本研究中,曬田組雌性克氏原螯蝦TG和TC含量上升幅度大于對照組,在曬田脅迫10 d時,曬田組TG和TC含量顯高于對照組,表明曬田環境脅迫可增加克氏原螯蝦體內能量貯存,用于合成卵巢發育相關激素,調控卵巢發育及繁殖相關活動。

LA和Glu可反映甲殼動物糖類代謝。LA能刺激甲殼類動物分泌高血糖激素,將Glu輸送到血淋巴作為厭氧菌底物,影響無氧代謝水平[33]。Glu作為甲殼動物代謝過程中主要的能量物質,可釋放大量能量,有利于應對不同環境脅迫[34-35]。本研究中,曬田組和對照組雌性克氏原螯蝦LA和Glu含量隨脅迫時間延長呈下降趨勢,在曬田脅迫10 d時達到最低值,曬田組下降幅度大于對照組,表明與正常養殖相比,曬田環境脅迫克氏原螯蝦可減少高血糖激素分泌,降低無氧代謝水平,且為應對曬田環境脅迫,克氏原螯蝦將減少能量釋放,將能量優先供給繁殖活動。這一變化可能與克氏原螯蝦特殊習性有關。

4 結 論

曬田環境脅迫期間共鑒定出4個克氏原螯蝦卵巢發育階段。隨脅迫時間增加,克氏原螯蝦不同組織卵黃蛋白原mRNA相對表達量及濃度均呈上升趨勢,卵黃蛋白原在肝胰腺的貢獻率大于卵巢貢獻率?？耸显r體內Hem、TP、LA和Glu含量降低,TG和TC含量升高,說明曬田環境脅迫對卵巢發育具有積極作用。