近紅外光譜技術(shù)無損檢測克咳片中麻黃類生物堿和嗎啡含量研究

孫 鵬，向超群，陳啟文，賈 彬，李欣怡，陳煒璇，喬衛(wèi)林*，肖 雪*

（1.中山市中智藥業(yè)集團有限公司，廣東 中山 528437；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，山東 濟南 250355；3.廣東藥科大學(xué) 廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心（中醫(yī)藥研究所），廣東 廣州 510006；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006）

克咳片由麻黃、罌粟殼、甘草、苦杏仁、萊菔子、桔梗、石膏七味藥組成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，主要用于治療咳嗽、喘急氣短［1］。方中麻黃的主要活性成分為麻黃類生物堿，包括鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，具有松弛平滑肌、收縮血管、抗炎、鎮(zhèn)咳平喘等作用［2-3］；罌粟殼主要含有嗎啡、那可汀、罌粟堿等生物堿，具有降低咳嗽中樞的興奮性、抑制咳嗽反射等作用［4-5］。《中華人民共和國藥典》（下稱《中國藥典》）2020年版第一部中克咳片含量檢測指標(biāo)為麻黃中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿、罌粟殼中的嗎啡［1］。傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法靈敏度高，但存在檢測成本高、效率低、具有破壞性等不足，不能實現(xiàn)高通量快速檢測，難以滿足克咳片中麻黃類生物堿以及嗎啡含量的大批量快速檢測要求。因此，建立一種快速、無損且準(zhǔn)確度高的檢測方法是實現(xiàn)克咳片質(zhì)量快速檢測的關(guān)鍵。

近紅外光譜（NIRS）因快速、無損、綠色、低成本等優(yōu)點，在多個行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。NIRS通過觀察待測物質(zhì)內(nèi)部各種氫鍵（X—H，如O—H、C—H、N—H 等）振動的倍頻和合頻吸收，以光譜信號的方式收集物質(zhì)內(nèi)部信息，進而對樣品指標(biāo)成分進行定性和定量分析，實現(xiàn)物質(zhì)的快速檢測［6-7］。偏最小二乘回歸（PLSR）作為一種線性校正方法，可全波長參與多元校正模型的建立，適用于處理高維數(shù)據(jù)和多重共線性問題。PLSR通過特定波長選擇方法篩選特征波長或波長區(qū)間，有望得到更好的定量校正模型［8］。

本文采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階解卷積導(dǎo)數(shù)（1stDec）、二階解卷積導(dǎo)數(shù)（2ndDec）、歸一化（Normalization）、平滑（SG）對光譜進行預(yù)處理，并利用PLSR 建立模型，以校正集決定系數(shù)（Rc2）、驗證集決定系數(shù)（Rp2）和相對分析誤差（RPD）為評價指標(biāo)，基于競爭自適應(yīng)重加權(quán)采樣（CARS）、最小絕對收縮和選擇算法（LASSO）、隨機蛙跳（RF）3種變量選擇方法進行模型優(yōu)化。結(jié)果顯示SNV 預(yù)處理結(jié)合CARS 變量選擇方法的模型最穩(wěn)定，預(yù)測效果最好。本文擬采用近紅外光譜技術(shù)建立克咳片的快速定量分析模型，以期為實現(xiàn)其質(zhì)量快檢提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

MPA Ⅱ型近紅外光譜分析儀（德國Bruker 公司），配備積分球漫反射檢測器。50 批克咳片（批號為20230122～20230205）由中山市中智藥業(yè)集團有限公司提供。

1.2 近紅外光譜的采集

實驗前，將近紅外光譜儀預(yù)熱30 min，并進行質(zhì)控檢測以保證儀器運行穩(wěn)定。光譜采集參數(shù)設(shè)置為吸光度，波長范圍為11550～3950 cm-1，采用積分球漫反射方式直接測定原片。樣品掃描時間為32 s，背景掃描時間為32 s，分辨率為16 cm-1，軟件為OPUS 8.5。實驗室溫度25 ℃。將采集的140個光譜數(shù)據(jù)用于校正集，260個光譜數(shù)據(jù)用于外部驗證。

1.3 含量測定

目標(biāo)物含量參考《中國藥典》2020年版一部中“克咳片含量測定”項測定。麻黃以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量計，罌粟殼以嗎啡計。

1.4 定量模型的建立

采用PLSR建立克咳片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定指標(biāo)——麻黃類生物堿和嗎啡的定量分析模型。首先利用蒙特卡羅交互驗證（MCCV）剔除光譜中的異常值，然后用SPXY（Sample Set Partitioning based on Joint X-Y distance）方法劃分兩個指標(biāo)的校正集和驗證集，再對光譜進行預(yù)處理和變量選擇。結(jié)合潛變量數(shù)（LVs）、R2和交叉驗證均方根誤差（RMSECV）、預(yù)測均方根誤差（RMSEP）及RPD建立定量分析模型。

1.5 外部驗證

比較麻黃類生物堿以及嗎啡外部驗證樣品預(yù)測值與真實值之間的差異，并通過模型預(yù)測率［9］（公式（1））以及預(yù)測值與真實值的關(guān)系判斷模型對外部驗證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 參數(shù)評價

通過決定系數(shù)（R2）、RMSECV、RMSEP 和RPD 對預(yù)測模型的性能和穩(wěn)定性進行評價。R2用于評估樣本預(yù)測值與真實值之間的相關(guān)程度，R2越接近1，表示預(yù)測值與真實值之間的相關(guān)程度越好；RMSECV 用于評估模型對校正集的預(yù)測能力，RMSECV 越小，表明模型的預(yù)測能力越強；RMSEP 用于評價模型對測試集的預(yù)測能力，RMSEP越小，表明模型的泛化能力越高；RPD 用于評價所建模型的穩(wěn)定性，RPD越大，模型穩(wěn)定性越好，通常RPD＞3時，可用于實際應(yīng)用。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用The Unscrambler X 10.4（挪威Camo Analytic 公司，Demo 版）軟件對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理并建立PLSR 模型；采用Matlab 軟件（R2022a，美國MathWorks 公司）對光譜數(shù)據(jù)進行MCCV、CARS、LASSO、RF處理，實現(xiàn)異常樣本的篩選和變量選擇；利用IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗；Origin Pro 2022b用于圖形繪制。算法包使用libPLSR和PLSR-da-v.0.9.4［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 含量測定結(jié)果

根據(jù)《中國藥典》［1］2020年版檢測方法，分別測得克咳片樣品的麻黃類生物堿總含量和嗎啡含量（見表1），兩者均具有相對較大的含量范圍。

表1 克咳片中麻黃類生物堿和嗎啡的樣本集劃分結(jié)果Table 1 Sample set partition results of ephedrine alkaloids and morphine in Keke tablets

2.2 近紅外光譜分析

克咳片的原始近紅外光譜如圖1A所示。圖中的光譜高度重疊，難以區(qū)分目標(biāo)成分的光譜信息。同時，近紅外光譜在采集時，容易受到散射、背景、噪聲等的影響。因此，建模前需要借助化學(xué)計量學(xué)方法對光譜數(shù)據(jù)進行分析。

圖1 經(jīng)不同方法預(yù)處理后克咳片的近紅外光譜圖Fig.1 NIR spectrograms of Keke tablets by different pretreatment methods

2.3 模型建立

2.3.1 數(shù)據(jù)集劃分首先采集140 個光譜數(shù)據(jù)用于校正集，使用10 折交叉驗證優(yōu)化模型參數(shù)，通過算法剔除個別異常光譜后，麻黃類生物堿選擇134個光譜數(shù)據(jù)用作校正集、內(nèi)部驗證；嗎啡選擇130個光譜數(shù)據(jù)作為校正集、內(nèi)部驗證，樣本集劃分結(jié)果見表1。為了更好地評估和檢驗?zāi)Ｐ托ЧM一步采集260個光譜數(shù)據(jù)用于外部驗證。

2.3.2 模型優(yōu)化光譜除含有樣品自身化學(xué)信息外，還包括其他無關(guān)信息和噪聲，在建立模型時需要進行消除［11］。本實驗通過對比None、SG、MSC、SNV、1stDec、2ndDec 對光譜的預(yù)處理效果（圖1A～F），發(fā)現(xiàn)SNV預(yù)處理得到的模型最穩(wěn)定，預(yù)測能力最好。這可能是因為SNV可消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對NIRS漫反射光譜的影響［12］。有研究將光譜進行分段處理，對分段后的區(qū)間進行SNV處理，其效果優(yōu)于對全譜進行SNV處理［13］。

CARS 是Liang 等［14］基于回歸系數(shù)及達(dá)爾文進化論提出的一種波長點選擇方法，具有速度快、預(yù)測精度高的特點，可有效選擇與所測性質(zhì)相關(guān)的最優(yōu)波長組合。LASSO 是在線性回歸的基礎(chǔ)上，通過增加范式函數(shù)，將模型回歸系數(shù)的絕對值約束在某一個設(shè)定的閾值，并最小化模型殘差平方和，只保留與目標(biāo)變量相關(guān)性高的解釋變量以實現(xiàn)特征變量的篩選，可對全光譜區(qū)間進行特征篩選，有效降低數(shù)據(jù)維度［15］。RF法由Li等［16］提出并用于疾病的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析，可在變量不多的情況下，通過計算每個變量被選的概率評價變量的重要性。由于冗余信息會掩蓋有效變量，導(dǎo)致光譜模型存在過擬合或欠擬合問題，增加模型的復(fù)雜性，降低其準(zhǔn)確性。借助變量選擇方法選擇最佳波長范圍，壓縮光譜數(shù)據(jù)，有助于簡化模型，減少計算量，提高模型質(zhì)量。研究表明，對波長變量進行篩選，既可剔除無關(guān)變量，又可實現(xiàn)模型簡化，提高模型的預(yù)測精度和穩(wěn)健性［17］。本實驗通過采用不同預(yù)處理方法結(jié)合不同的變量選擇方法，選取最佳LVs，優(yōu)化模型，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示SNV預(yù)處理方法結(jié)合CARS變量選擇所得結(jié)果最佳。

表2 不同預(yù)處理方式結(jié)合不同變量選擇方法的結(jié)果Table 2 Results of different pretreatment methods combined with different variables selection methods

麻黃類生物堿及嗎啡的變量選擇結(jié)果見表2。采用CARS法選擇波數(shù)變量時，麻黃類生物堿主要位于11600～8000 cm-1、7000 cm-1以及4000 cm-1附近3個區(qū)域，嗎啡主要位于11600～8000 cm-1、7000 cm-1以及5000～4000 cm-13個區(qū)域（圖1D）。兩者在11600～8000 cm-1范圍篩選的波數(shù)變量較多，主要由C—H伸縮振動產(chǎn)生；7000 cm-1處的波數(shù)則主要由游離O—H鍵一倍頻的伸縮振動產(chǎn)生；5000～4000 cm-1區(qū)域主要為C—H、—CH2、—CH3組合頻的吸收［18-20］。克咳片中的麻黃類生物堿以及嗎啡富含羥基、甲基、亞甲基、酚羥基等官能團，在空間結(jié)構(gòu)中容易形成氫鍵。故CARS法所篩選的變量可反映指標(biāo)成分相關(guān)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.3.3 模型建立與內(nèi)部驗證結(jié)果經(jīng)SNV+CARS 優(yōu)選后建立的麻黃類生物堿及嗎啡含量的PLSR 模型如表3及圖2所示，兩者的Rc2、Rp2、RMSECV、RMSEP、RPD值分別為0.91、0.93、0.1540、0.1164、4.00 和0.92、0.94、0.0249、0.0194、4.24。模型的RMSECV 和RMSEP 值相近且較低表明模型穩(wěn)定，性能較好，未出現(xiàn)過擬合；Rc2和Rp2接近1，說明模型的線性關(guān)系良好；兩者的RPD＞3，說明模型的預(yù)測能力較好［21］。

表3 麻黃類生物堿以及嗎啡的內(nèi)部驗證結(jié)果Table 3 Internal verification results of ephedrine alkaloids and morphine

2.4 外部驗證結(jié)果

根據(jù)《中國藥典》2020年版規(guī)定，克咳片中麻黃含量以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量計，不得少于2.5 mg；每片含有的罌粟殼以嗎啡計，應(yīng)為0.15～1.10 mg。對麻黃類生物堿和嗎啡的真實值和預(yù)測值進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，結(jié)果顯示兩者真實值與預(yù)測值無顯著性差異（麻黃P=0.554，嗎啡P=0.790）。其中麻黃類生物堿含量的預(yù)測率為83.26%～99.99%，嗎啡含量的預(yù)測率為84.80%～99.96%，且預(yù)測結(jié)果均符合藥典規(guī)定，見圖3。結(jié)果表明預(yù)測值與真實值之間具有較好的相關(guān)性，說明所建立的PLSR 模型預(yù)測性能較好。

圖3 克咳片中麻黃類生物堿（A）和嗎啡（B）的預(yù)測值與真實值Fig.3 Predicted values and actual values of ephedrine alkaloids（A） and morphine（B） in Keke tablets

3 結(jié) 論

本研究參考藥典方法測定了不同批次克咳片中的麻黃類生物堿以及嗎啡含量，首次利用無損方式采集了不同批次克咳片的近紅外光譜，經(jīng)不同預(yù)處理、變量選擇和LVs 選擇后，麻黃類生物堿、嗎啡含量兩個模型的RPD 值分別為4.00、4.24，說明模型性能較好，具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確性，能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)中快速且無損的檢測要求，為克咳片的質(zhì)量控制提供了一種新的方法。