基于Eu3+-生物質(zhì)碳量子點探針的比率型熒光傳感體系檢測鹽酸四環(huán)素

李春雨，趙卓君，白萬喬，高樓軍

（延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點實驗室，陜西 延安 716000）

鹽酸四環(huán)素（TET）作為一種抗生素因吸收效果好、價格低廉、廣譜活性而被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中動物疾病的預(yù)防和治療［1-3］。但鹽酸四環(huán)素使用不當(dāng)時會導(dǎo)致其殘留通過食物鏈傳播，并在人體中累積，對人體產(chǎn)生危害，如耐藥性、過敏反應(yīng)、胃腸道疾病、腎臟和肝臟損害等［4-6］。

目前，已報道的鹽酸四環(huán)素的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［7］、毛細(xì)管電泳法（CE）［8］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［9］、化學(xué)發(fā)光法［10］、電化學(xué)分析法［11］等，但這些技術(shù)大多需要昂貴的設(shè)備、專業(yè)的操作人員，且耗時較長。而熒光分析方法具有操作簡單、靈敏度高、響應(yīng)快等優(yōu)點，可用于豬肉中四環(huán)素的檢測。生物質(zhì)碳量子點（CDs）是一種新型的碳納米材料，因制備方法簡單、細(xì)胞毒性低、生物相容性高、光穩(wěn)定性良好而受到廣泛關(guān)注，主要應(yīng)用在熒光探針、生物成像、光催化和光電器等領(lǐng)域［12-14］。目前已有許多以生物質(zhì)材料為碳源成功合成的生物質(zhì)碳量子點報道，如使用香蕉［15］、牛奶［16］、枸杞［17］等制備碳量子點。另外，由于四環(huán)素含有β-二酮酸鹽構(gòu)型，可以作為一種很好的配體通過“天線效應(yīng)”螯合銪離子（Eu3+）后發(fā)射出特征熒光［18］，銪基熒光探針已成為四環(huán)素檢測的焦點。

本研究以橙皮為原料制備了碳量子點，并與Eu3+共同作為熒光基團(tuán)，構(gòu)建雙發(fā)射比率型熒光探針（Eu3+-CDs），用于抗生素鹽酸四環(huán)素的檢測（圖1）。隨著TET 濃度的增加，一方面由于“內(nèi)濾效應(yīng)”，所制備的生物質(zhì)CDs 在425 nm 處的熒光逐漸被TET 猝滅；另一方面，TET 與Eu3+螯合形成配合物，使得617 nm 處的熒光逐漸增強(qiáng)。其熒光強(qiáng)度比（IF617/IF425）與TET 的濃度直接相關(guān)。所構(gòu)建的比率型熒光探針Eu3+-CDs 不但可以減少光源不穩(wěn)定等因素帶來的檢測誤差，還可以顯著提高分析方法的準(zhǔn)確度［19］，有望用于肉類中鹽酸四環(huán)素的高靈敏測定。

圖1 Eu3+-CDs熒光探針的構(gòu)建及其用于鹽酸四環(huán)素檢測的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the fabrication of Eu3+-CDs fluorescence probe and its application for the detection of tetracycline hydrochloride

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

F-7000 熒光分光光度計（日本日立有限公司）；UV3600PLUS220/230VC 紫外可見分光光度計（日本島津有限公司）；Nicolet iS20 傅里葉變換紅外光譜儀、K-Alpha X 射線光電子能譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；DHG-9145AF電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）。

Eu（NO3）3·6H2O、鹽酸四環(huán)素、十二烷基磺酸鈉、三氯乙酸、阿奇霉素、紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、氨芐西林、硫酸鏈霉素、頭孢曲松鈉、組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、乳糖和半乳糖等均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。以上藥品均為分析純。橙子、豬肉購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物質(zhì)碳量子點的制備將橙皮在60 ℃下烘干后，研磨成粉末。準(zhǔn)確稱取0.04 g 橙皮粉末，分散在25 mL 超純水中。隨后將混合物轉(zhuǎn)入50 mL 聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)，190 ℃下反應(yīng)4 h。待自然冷卻至室溫后，用0.45 μm 的針頭過濾器過濾產(chǎn)物，得到的黃色溶液即為橙皮CDs 的分散水溶液。將其置于4 ℃保存，備用。

1.2.2 熒光探針的構(gòu)建配制0.01 mol/L 的Eu（NO3）3·6H2O 溶液和1×10-4mol/L的十二烷基磺酸鈉溶液。將5 mL 0.01 mol/L 的Eu（NO3）3·6H2O 溶液與0.6 mL1×10-4mol/L 的十二烷基磺酸鈉溶液混合均勻，制備Eu3+溶液。取300 μL 稀釋16 倍的CDs 溶液與70 μL Eu3+溶液于比色皿中，搖勻后再加入50 μL pH 5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，即得到Eu3+-CDs熒光探針溶液。

1.2.3 Eu3+-CDs熒光探針對TET的檢測向420 μL熒光探針溶液中加入不同濃度的鹽酸四環(huán)素，用去離子水定容至1 mL，并于室溫下振蕩1 min。用熒光分光光度計測定并記錄617 nm 與425 nm 處的熒光強(qiáng)度IF617與IF425，計算兩者的比值IF617/IF425。測定條件：激發(fā)波長為370 nm，檢測波長范圍為390～680 nm，光電倍增管電壓為700V，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的表征

通過透射電鏡（TEM）對制得的CDs 進(jìn)行表征。如圖2A 所示，CDs 呈準(zhǔn)球形，且分散良好，平均粒徑為（4.04±0.22） nm。CDs 的高分辨率TEM（圖2A 插圖）呈現(xiàn)出高度平行和有序的晶格條紋，面間距為0.21 nm，證明制得的CDs 具有良好的結(jié)晶性［20］。使用傅里葉紅外光譜（FT-IR）對CDs 的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征，如圖2B 所示，在3352 cm-1和3 365 cm-1處的譜帶和峰分別歸屬于O—H 和N—H 的伸縮振動［21］，處于1540～1730 cm-1范圍的譜帶歸屬于C=O和C=C的伸縮振動［22］。

圖2 CDs的TEM圖（A）和 紅外光譜圖（B）Fig.2 TEM image（A） and FT-IR spectrum（B） of CDs insert A：enlarged TEM image

采用X 射線光電子能譜（XPS）對CDs 的元素含量進(jìn)行分析。如圖3A 所示，制備的CDs 主要包含C（65.37%）、N（2.53%）和O（32.10%）3 種元素。在CDs 的C1s 譜圖（圖3B）上，有3 個結(jié)合能分別為288.4、286.3、284.7 eV的主峰，說明CDs表面存在C—C/C=C、C—O、C=O/C=N等基團(tuán)。N1s譜圖（圖3C）位于399.71 eV 的主峰說明了C—N 等基團(tuán)的存在。O1s 光譜（圖3D）位于532.52 eV 的主峰，表明所制備的CDs表面存在 C=O等基團(tuán)［23］。XPS結(jié)果和FT-IR數(shù)據(jù)基本吻合，表明合成的CDs表面富含氨基、羥基、羧基等親水基團(tuán)，因此在水溶液中分散性良好。

圖3 CDs的XPS的全譜圖（A）以及高分辨C1s譜圖（B），高分辨N1s譜圖（C），高分辨O1s譜圖（D）Fig.3 The XPS survey spectrum（A） and high-resolution C1s spectrum（B），high-resolution N1s spectrum（C），high-resolution O1s spectrum（D） of synthesized CDs

2.2 CDs的光學(xué)性質(zhì)

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜考察CDs的光學(xué)性能，如圖4所示，CDs在紫外吸收區(qū)呈現(xiàn)出明顯的吸收，可歸因于C=C的π-π*躍遷［24］。當(dāng)激發(fā)波長為370 nm時，CDs的最大發(fā)射峰位于425 nm處。

圖4 CDs的紫外-可見吸收光譜（Abs）、熒光激發(fā)（Ex）和熒光發(fā)射光譜（Em）Fig.4 UV-Vis absorption（Abs），fluorescence excitation（Ex） and emission（Em） spectra of CDs

2.3 Eu3+-CDs探針制備條件的優(yōu)化

為提高CDs 熒光探針的靈敏度，對Eu3+的濃度、pH 值和反應(yīng)時間等實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，探究了在不同Eu3+濃度（10～100 μmol/L）、不同pH 值（pH 2.0～6.0）、不同反應(yīng)時間（15～300 s）條件下制備的Eu3+-CDs 探針的熒光性能。結(jié)果顯示，IF617/IF425分別在Eu3+溶液濃度70 μmol/L、pH 5.8 時達(dá)到最大值（圖5A～B），說明該條件下探針的熒光性能最好，因此后續(xù)選擇在該條件下進(jìn)行實驗。反應(yīng)進(jìn)行90 s時，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定（圖5C），此時反應(yīng)達(dá)到平衡。因此確定90 s為最佳反應(yīng)時間。

圖5 Eu3+濃度（A）、pH值（B）、反應(yīng)時間（C）對探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of Eu3+ concentration（A），pH valve（B） and reaction time（C） on probe fluorescence intensity

2.4 Eu3+-CDs熒光探針對鹽酸四環(huán)素的選擇性

在優(yōu)化實驗條件下，以阿奇霉素（AZM）、紅霉素（EM）、氟苯尼考（FF）、阿莫西林（AML）、硫酸新霉素（NEO）、硫酸卡那霉素（KM）、氨芐西林（AMP）、硫酸鏈霉素（STR）、頭孢曲松鈉（CTR）、組氨酸（His）、絲氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）、賴氨酸（Lys）、苯丙氨酸（Phe）、葡萄糖（Glu）、乳糖（Lac）和半乳糖（Gal）等抗生素以及常見的陽離子（Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Hg2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、Al3+）和陰離子（Cl-、SO2-4、Ac-、NO-3、CO2-3）為干擾離子，各抗生素及干擾離子的濃度均為100 μmol/L，考察了Eu3+-CDs 熒光探針對鹽酸四環(huán)素的選擇性。如圖6 所示，Eu3+-CDs熒光探針僅對鹽酸四環(huán)素產(chǎn)生比較顯著的熒光強(qiáng)度比信號，表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。

圖6 不同抗生素、陰陽離子對Eu3+-CDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effects of different anions and cations on fluorescence intensity of Eu3+-CDs

2.5 Eu3+-CDs熒光探針對鹽酸四環(huán)素的熒光檢測性能

隨著鹽酸四環(huán)素濃度的升高，425 nm 處CDs 的熒光逐漸減弱，而由于越來越多的鹽酸四環(huán)素與Eu3+螯合形成配合物，使得617 nm 處的熒光逐漸增強(qiáng)（圖7A）。在鹽酸四環(huán)素濃度（c，μmol/L）10～100μmol/L 范圍內(nèi)，IF617/IF425與鹽酸四環(huán)素濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為IF617/IF425=0.01561c（μmol/L） +0.05081（圖7B），相關(guān)系數(shù)r2=0.9926。根據(jù)3δ/S（δ為7次空白樣品檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為線性方程的斜率）計算，得到方法的檢出限為5.09 μmol/L。

圖7 不同濃度鹽酸四環(huán)素的熒光強(qiáng)度（A） 和熒光強(qiáng)度比（IF617/IF425）與鹽酸四環(huán)素濃度的線性擬合結(jié)果（B）Fig.7 Fluorescence intensity for various concentrations of TET（A） and fitting curve of IF617/IF425 vs. TET concentration（B）

將本方法與已有的測定TET 的方法進(jìn)行對比，如表1 所示。結(jié)果表明，本文所構(gòu)建的熒光探針在檢測TET時具有較寬的線性范圍及較低的檢出限，檢測性能良好。

表1 不同TET檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for detection of TET

2.6 可能的機(jī)理探究

考察了Eu3+、Eu3+-TET 和TET 的紫外可見吸收光譜。由圖8A 可見，與Eu3+配位后，TET 位于273 nm 和358 nm 處的吸收峰消失，在305 nm 和399 nm 處出現(xiàn)了新的吸收峰，表明Eu3+與TET 發(fā)生相互作用，生成了新物質(zhì)［30］，且該物質(zhì)隨著TET濃度的增加而增加。因此，在617 nm 處出現(xiàn)的熒光峰強(qiáng)度隨著TET濃度的增加而增加。

圖8 Eu3+、Eu3+-TET和TET的紫外可見吸收光譜（A），Eu3+- TET的紫外可見吸收光譜和CDs的激發(fā)光譜（B），CDs和 Eu3+-CDs-TET的熒光壽命曲線（C）Fig.8 UV-Vis absorption spectra of Eu3+，Eu3+- TET and TET（A），UV-Vis absorption spectra of Eu3+- TET and fluorescence excitation spectra of CDs（B），fluorescence lifetime curves of CDs and Eu3+-CDs-TET（C）

從Eu3+-TET 的紫外可見吸收光譜和CDs 的熒光激發(fā)光譜（圖8B）圖可觀察到，兩者存在部分重疊，熒光猝滅現(xiàn)象符合“內(nèi)濾效應(yīng)”［31-32］。另外，測定了CDs及添加70 μmol/L 鹽酸四環(huán)素后Eu3+-CDs溶液的熒光壽命，其熒光衰減曲線如圖8C 所示。熒光壽命測定結(jié)果（表2）顯示，Eu3+-CDs 探針與TET 結(jié)合前后的熒光壽命分別為2.84 ns和2.33 ns，變化不大，推測TET對CDs的熒光猝滅效應(yīng)可能由靜態(tài)猝滅導(dǎo)致［33］。因此，TET 對CDs 的猝滅是內(nèi)濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅協(xié)同作用的結(jié)果，導(dǎo)致425 nm 處的熒光峰強(qiáng)度隨著TET濃度的增加而降低。

表2 Eu3+-CDs和Eu3+-CDs-TET的熒光壽命結(jié)果Table 2 Fluorescence lifetime result of Eu3+-CDs and Eu3+-CDs-TET

2.7 豬肉中鹽酸四環(huán)素的測定

為了驗證方法的實用性，對空白豬肉樣品分別進(jìn)行10.00、30.00、50.00 μmol/L 3 個水平的加標(biāo)回收實驗，每個樣品平行測定3 次，結(jié)果如表3 所示。所得加標(biāo)回收率為102%～110% ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.20%～2.4%。結(jié)果表明該方法用于肉類中鹽酸四環(huán)素的檢測具有很好的實用性。

表3 豬肉樣品中鹽酸四環(huán)素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of TET in spiked pork samples

3 結(jié) 論

以橙皮為原料制備的碳量子點和銪離子為熒光基團(tuán)，構(gòu)建了雙發(fā)射比率型熒光探針（Eu3+-CDs）對鹽酸四環(huán)素含量進(jìn)行檢測。在10～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，鹽酸四環(huán)素的檢出限為5.09 μmol/L。該方法成功用于豬肉中鹽酸四環(huán)素含量的檢測，加標(biāo)回收率為102%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、制備方法簡單、綠色環(huán)保、便于推廣等優(yōu)點，在肉類抗生素的檢測方面具有較大潛力。