基于HS-SPME/GC-MS/O 分析滇綠茶特征香氣物質

楊 雪，王 靜，2，胡月朦，韋朝領，2，翟小婷，2*

（1.安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.安徽農業大學 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036）

滇綠茶，即云南綠茶，產于云南省臨滄、保山等地［1］。滇綠茶選用芽葉肥壯，茶多酚含量高的云南大葉種鮮葉做原料，精選細嫩的一芽二葉，經過殺青、揉捻、烘干等工藝處理制成。由于高溫殺青，及時揉捻，抑制了酶活性和多酚氧化，防止了芽葉過度發酵，使得滇綠茶保持黃綠的色澤，形成滋味醇濃、香氣持久、回味悠長、湯色黃綠的特點［2］。

綠茶香氣類型可分為栗香型、清香型與花香型等［3］。綠茶香氣物質含量低、組成復雜，因而較難分析。近年來，Feng等［4］采用氣相色譜-質譜（GC-MS）技術證明了不同工藝可賦予六大茶類不同類型的香氣特性。張銘銘等［5］采用頂空固相微萃取（HS-SPME）結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GCTOF MS）技術明確了異丁醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛、苯乙醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮和β-紫羅蘭酮是栗香型綠茶的特征香氣物質基礎。潘思竹［6］采用頂空分析結合GC-MS 鑒定出貴州6 種嫩栗香型綠茶中的53種揮發性成分，發現芳樟醇、β-紫羅蘭酮、對傘花烴、茉莉酮、香葉醇和β-苯乙醇對綠茶的清香與栗香具有貢獻作用。余勝奎等［7］采用同時蒸餾萃取（SDE）結合GC-MS 從滇綠茶和滇紅茶中分別鑒定出74種和61種揮發性成分，并指出滇綠茶的特征揮發性成分為苯乙醛，滇紅茶的揮發性成分為α-松油醇和β-蒎烯。

目前，滇綠茶的特征香氣成分未見系統報道，關鍵香氣物質不明確制約了滇綠茶的開發利用。HS-SPME 是一種選擇性非溶劑萃取法，廣泛應用于茶葉和茶湯的香氣分析［3］。氣相色譜-質譜/嗅聞技術（GC-MS/O）將儀器分析和人類嗅覺感官評價相結合，可分析食品中香氣成分，其結果準確可靠，已成為食品風味分析領域的最主要方法之一［8］。本研究采用HS-SPME結合GC-MS/O分析滇綠茶的特征香氣成分，可為滇綠茶的香氣品質提升和工藝改進提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

26批滇綠茶樣于2021年制作，來自云南當地茶葉企業，茶樣信息見表1。

表1 滇綠茶樣及來源Table 1 Dian green tea samples and their origins

（續表1）

1.2 香氣標準品與試劑

二甲基硫醚、己醛、萘、水楊酸甲酯、香葉醇、β-大馬士酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2，3-辛二酮、苯甲醇和苯甲醛（美國Aladdin 公司）；芳樟醇、二氫芳樟醇、苯乙醛、γ-松油烯、檸檬醛、2，4-二叔丁基苯酚和（Z）-3-己烯-1-醇（德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；α-柏木烯、2-庚酮、2-乙基呋喃、正己醇、（+）-檸檬烯、β-二氫紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮（上海Macklin 公司）；1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇、2-甲基戊醛和2-甲基丁醛（上海TCI公司）；二氫獼猴桃內酯、香葉基丙酮（上海甄準生物科技有限公司）；（E，E）-2，4-庚二烯醛、庚醛、癸醛、正戊醛、（E）-4-庚烯醛、β-環檸檬醛、茶香螺烷、（E）-β-羅勒烯和藏紅花醛（加拿大TRC 公司）；月桂烯、2-茨酮、間傘花烴、對傘花烴、雪松醇和C5～C30正構烷烴系列標準品（上海Sigma-Aldrich 公司）；1-壬醇、4-萜烯醇、2-甲基萘、苯乙酮、茉莉酮、異佛爾酮、苯乙烯、對二甲苯、鄰二甲苯、乙基苯、2-乙酰基吡咯、茶吡咯、吲哚、苯乙腈、N-甲基吡咯和3-乙基-2，5-甲基吡嗪（上海源葉生物科技有限公司）；氯化鈉、丙酮（分析純，國藥集團上海有限公司）；純凈水（中糧可口可樂華中飲料有限公司）。

1.3 儀器與設備

20 mL 頂空進樣瓶和7890B-5977B 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；EX125DH 十萬分之一分析天平（美國OHAUS 公司）；ODP3 嗅聞儀（德國Gerstel 公司）；50/30 DVB/CAR/PDMS 萃取頭和SPME手動進樣手柄（美國Supelco公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州市英峪予華儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 傳統感官審評和香氣定量描述性分析傳統感官審評：根據GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》［9］，在標準的茶葉感官審評室中進行傳統感官審評。稱取3 g 茶葉置于評茶杯中，以1∶50 的茶-水質量比用沸水浸泡5 min后，等速濾出茶湯，留葉底于評茶杯中。茶葉香氣的感官審評由8位受過茶葉感官審評培訓且有經驗的小組成員完成，并記錄各茶樣的香氣特征。

香氣定量描述性分析（QDA）：從安徽農業大學招募25 名經驗豐富的感官評定員（22～32 歲），組成感官評定小組并進行每周一次的專業氣味訓練，訓練周期為1年以上。訓練時，感官評定員嗅聞識別多種香氣標準品水溶液、混合香氣標準品水溶液的香氣屬性組成及其對應的化合物，并通過香氣識別食物。此外，感官評定員要求通過參加GC-O 嗅聞樣品以及參加感官實驗加強嗅覺的靈敏度。香氣定量描述性分析實驗時，對樣品進行整體氣味評估以評估滇綠茶湯的香氣輪廓和整體香氣差異。參考感官評定員的初步嗅聞結果，選擇以下8 種香氣標準品水溶液作為滇綠茶湯的標準氣味描述詞，定義樣品中的主要氣味類別：苯甲醇（果香）、β-紫羅蘭酮（花香）、吲哚（清香）、3-乙基-2，5-甲基吡嗪（烘烤香）、2-甲基丁醛（麥芽香）、苯乙醛（蜜香）、2，3-辛二酮（奶香）、己醛（青草香）。將選定的香氣標準品以超過氣味閾值100倍的濃度溶于水中，將標準品水溶液和茶湯（15 mL）分別裝在有蓋的無味玻璃瓶中（內徑：40 mm，總體積：60 mL）。由每位感官評定員評估每個樣品中各氣味類別的氣味強度，繪制整體氣味強度的雷達圖。氣味強度分7個等級：“0”為無香氣；“0.5”為香氣強度較弱；“1.0”為香氣強度弱；“1.5”為香氣強度中等；“2.0”為香氣強度較強；“2.5”為香氣強度強；“3.0”為香氣強度極強。

1.4.2 揮發性成分的提取富集采用HS-SPME 富集茶湯的揮發性成分［10］。以癸酸乙酯作為定量分析的內標物，采用標準加入法對待測物進行半定量分析。將3 g干茶置于250 mL錐形瓶中，按茶-水質量比1∶50，加入150 mL 開水，靜置5 min 后，用紗布濾出茶湯，迅速置于冰水浴中冷卻至室溫。吸取10 mL 茶湯于頂空瓶中，加入2 g 氯化鈉和1 μL 癸酸乙酯（10 mg/L），30 ℃水浴，磁力攪拌平衡15 min。SPME萃取頭吸附30 min，在進樣口解吸附5 min待分析。

1.4.3 GC-MS/O 條件［11］色譜條件：HP-5MS 熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm，美國Agilent公司），進樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，載氣流速為1 mL/min，不分流進樣。柱溫箱升溫程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，再以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質譜條件：電子轟擊離子源正模式（ESI+），電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，單四極桿溫度為150 ℃，采用全掃描模式，質量掃描范圍30～350m/z。

嗅聞條件：ODP3嗅聞儀設置為200 ℃。GC-O感官分析由安徽農業大學的3名感官評定員完成。

1.4.4 GC-MS/O 實驗 從氣相色譜柱尾端洗脫出的待測物通過安捷倫Dean switch分流裝置均勻分為2份，一部分通過一根空柱進入MS記錄待測物的質譜信息和保留時間；另一部分通過等長的空柱進入ODP3嗅聞儀，感官員從ODP3嗅聞儀嗅聞，記錄待測物的氣味屬性和強度。氣味強度采用5點刻度法：0表示未聞到；1表示微弱；2表示中等；3表示較強；4表示極強。每種物質的氣味屬性需要至少兩名感官員描述一致才能確定，香氣強度取平均值。所有實驗至少重復3次。

1.5 數據處理

定性分析：根據C5～C30正構烷烴標準品的保留時間和保留指數（RI）計算公式，測定各色譜峰的RI。根據碎片離子質譜信息匹配NIST17.L譜庫對待測成分進行結構鑒定。最后，通過比對香氣標準品和待測物的氣味屬性、保留指數和質譜信息，確定香氣物質的名稱和化學結構［12］。

相對定量分析：以50 mg/L 的癸酸乙酯為內標物，認定校正因子為1，根據樣品中各色譜峰與內標物峰面積的比值以及內標物濃度，測定揮發性成分的相對濃度和含量。所有實驗至少重復3次。

2 結果與討論

2.1 不同小產區滇綠茶的香氣物質差異

如圖1 所示，根據產地將26 個茶樣分為四組進行GC-MS 分析。圖1A 中，S3 和S4 均為云南佛香茶，其色譜圖差異較大，表明相同品種制得的茶葉也會因工藝參數和采摘嫩度不同而產生香氣品質差異。大賽茶葉合作社生產的4 種滇綠茶色譜圖（圖1B）重合度很好，表明其香氣品質的一致性較好。南澗縣茶廠生產的13 個滇綠茶樣產地相同，雖然其品種和生產時間差異較大，尤其是采摘時間從3月到10月包含了春茶和夏秋茶，然而上述茶樣的揮發性成分色譜圖輪廓大體相似，僅存在細微差異（圖1C）。其他茶廠生產的滇綠茶香氣差異更為顯著（圖1D）。

圖1 4組滇綠茶樣的總離子流圖Fig.1 The total ion current chromatograms（TIC） of 4 groups Dian green tea samples

2.2 3種典型滇綠茶的傳統感官審評與香氣定量描述性分析

按照國家標準GB/T 23776-2018［9］，對26 批滇綠茶樣進行傳統感官審評，結果顯示所有樣品均符合上述標準。其中，S3 和S6 號樣品表現為嫩香，但S6 號樣品香氣不持久；S15 號樣品表現為豆香和栗香，且香氣較持久。上述3 個樣品（S3、S6 和S15）的干茶、湯色、葉底和香氣特征如圖2 所示，其香氣和滋味審評結果均為95分以上，說明其風味品質較好。故選擇上述3 個樣品進行香氣定量描述性分析，以對滇綠茶湯的整體香氣進行初步認識，結果如圖3 所示。滇綠茶的香氣輪廓包括果香、花香、清香、蜜香、奶香、烘烤香、麥芽香和青草香8 種主要氣味特征。其中，S3 和S6 號樣品花果香和蜜香的香氣強度較高，S15號樣品烘烤香和奶香的香氣強度較高。3個茶樣的整體香氣馥郁，是典型的滇綠茶。綜合傳統感官審評和香氣定量描述性分析結果，最終選擇S3、S6和S15號樣品進行HS-SPME/GC-MS/O分析。

圖2 3個滇綠茶樣品的傳統感官審評結果Fig.2 The results of Chinese traditional sensory evaluation of three Dian green tea samples

圖3 3個滇綠茶樣品的香氣定量描述性分析結果Fig.3 The results of aroma descriptive analysis of three Dian green tea samples

2.3 3種典型滇綠茶的GC-MS/O定性和嗅聞結果

上述3 個樣品的香氣物質定性分析結果如表2 和圖4 所示。將GC-MS/O 分析結果與香氣標準品的香氣特征及強度、在HP-5MS 毛細管柱上的相對保留指數和在ESI+模式下的質譜信息比對，共鑒定出83 種香氣物質，包括22 種脂肪烴和芳香烴、15 種醇、14 種醛、14 種酮、11 種雜環化合物、5 種酯、1種酚以及1種含硫化合物。3種滇綠茶湯中嗅聞到的香氣屬性主要有柑橘香、杏仁香、果香、花香、蜜香、薄荷味、青草香等，對應的香氣物質主要有32 種，其化合物名稱和香氣屬性分別為二甲基硫醚（玉米香）、2-甲基戊醛（杏仁味/花香）、己醛（青草香）、（E）-2-己烯醛（青蘋果味/杏仁味）、（Z）-3-己烯-1-醇（萵苣味）、己醇（青草香/杏仁味）、2，5-二甲基-2-己醇（青草香/杏仁味）、庚醛（青草香）、苯甲醛（杏仁味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、2，3-辛二酮（奶香）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（爆米花香）、月桂烯（柑橘味/花香）、（E，E）-2，4-庚二烯醛（花香）、3-乙基-2，5-甲基吡嗪（烘烤香）、芳樟醇（柑橘味/花香）、二氫芳樟醇（檸檬味/甜香）、α-環檸檬醛（番茄味）、（E）-β-羅勒烯（羅勒草香）、水楊酸甲酯（清涼/薄荷味）、藏紅花醛（藥草香/甜香）、吲哚（樟腦香）、茶香螺烷（蜂蜜味）、β-大馬士酮（煮蘋果味）、茉莉酮（花香）、α-柏木烯（松針味/甜香）、α-紫羅蘭酮（花香/紫羅蘭香）、β-二氫紫羅蘭酮（花香/紫羅蘭香）、β-紫羅蘭酮（花香/紫羅蘭香）、香葉醇（玫瑰香/柑橘味）、香葉基丙酮（青草香）和2，4-二叔丁基苯酚（酚香）。3 個茶樣中，香氣強度最高的為2，3-辛二酮（奶香）、月桂烯（柑橘香/花香）、（E，E）-2，4-庚二烯醛（花香）、苯甲醛（杏仁味）、芳樟醇（柑橘香/花香）、二氫芳樟醇（檸檬味/甜香）、香葉醇（玫瑰香/柑橘味）、檸檬烯（柑橘味）、別羅勒烯（羅勒草香）、己醇（青草味/杏仁味）、β-大馬士酮（煮蘋果味）、茉莉酮（花香）和β-紫羅酮（花香），其香氣強度在某一個樣品中≥2.5，上述化合物對滇綠茶的特征香氣品質具有重要貢獻。

圖4 3種滇綠茶中共同的香氣物質種類和數量分布Fig.4 The type and amount distributions of the aroma compounds in all the three Dian green teas

表2 3個滇綠茶樣品中香氣物質的GC-MS/O分析結果Table 2 GC-MS/O analysis results of aroma compounds of in 3 Dian green tea samples

（續表2）

2.4 3種典型滇綠茶中香氣物質的相對含量

由3種典型滇綠茶中香氣物質的相對定量分析結果（見表3）可知，醛類化合物雖然不是最多，但含量普遍較高。分子量低的脂肪醛（碳個數少于10）含量多大于0.2%，如己醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、癸醛、正戊醛等；芳香醛中苯甲醛的含量較高，平均相對含量達到0.267%，苯乙醛的含量較低；環烯醛中β-環檸檬醛具有較高含量（0.109%）。然而，烯醛類化合物的相對含量在滇綠茶的香氣成分中普遍不高，例如（E）-4-庚烯醛和（E）-2-己烯醛的平均含量為0.011%～0.013%。酮類化合物的相對含量在滇綠茶的香氣成分中普遍較高，相對含量大于0.1%的化合物為4-甲基-3-戊烯-2-酮、β-紫羅蘭酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香葉基丙酮、2，2，6-三甲基環己酮。醇類化合物相對含量較高的成分主要為二氫芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇和1-戊醇。雜環類化合物中，N-乙基吡啶、茶吡咯、2-乙基呋喃、吲哚和2-甲基-4-甲氧基苯胺的含量相對較高，其平均含量分別為0.820%、0.246%、0.149%、0.070%和0.070%。滇綠茶中酯類化合物的種類較少，除水楊酸甲酯（0.166%）外，其他酯類化合物的含量普遍較低。此外，在滇綠茶中僅檢測到1 種內酯類化合物二氫獼猴桃內酯，且其含量不高。滇綠茶中烴類化合物最多，但平均相對含量均不高。其中芳香烴類化合物中間傘花烴的平均相對含量最高，其次是脂肪族烯烴中的檸檬烯。

表3 3個滇綠茶樣品中香氣物質的相對含量Table 3 The relative contents of aroma compounds in 3 Dian green tea samples

結合表2 和表3 的結果分析發現，在41 種較高含量（＞ 0.05%）的香氣物質中，醇類、醛類、酮類、酯類等具有較好的香氣屬性，對滇綠茶的香氣品質形成起著直接貢獻作用。醇類化合物通常呈現愉悅的花果香氣。尤其烯醇類化合物，例如芳樟醇、二氫芳樟醇、香葉醇等呈現花果香，是影響茶葉香氣品質的重要組成，也是多種綠茶的關鍵香氣成分［3，16］；1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇則具有特征的蘑菇和泥土味，屬不愉悅氣味，通常在綠茶中含量較低。然而其在滇綠茶中相對含量較高，說明需進一步選擇適制滇綠茶的茶樹品種和工藝參數，以減少1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇的含量，提高香氣品質。醛類化合物與形成茶葉香氣和各種特異香氣風格有密切關系［11］，其在滇綠茶香氣組成中的含量比例較高。芳香醛如苯甲醛主要呈現杏仁味。而脂肪醛種類較多，主要呈現清香和花香味。其中，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等低沸點醛具有麥芽的清香，是由亮氨酸和異亮氨酸通過Strecker降解反應形成［17］。己醛是綠茶中重要的新茶香物質，是很多綠茶清香的重要來源［18］。酯類物質大多呈現濃烈的果香，然而茶葉中常見的水楊酸甲酯呈現強烈的清涼感［3］，對滇綠茶香氣品質具有突出貢獻作用。酮類化合物是滇綠茶中另一類主要香氣成分，香氣特征與其結構關系密切。例如直鏈酮6-甲基-5-庚烯-2-酮呈現明顯的烘烤香，帶彌散的爆米花香，是茶葉烘烤香形成的重要因子［12，14］。而呈現紫羅蘭香的環狀酮β-紫羅蘭酮由于其在水中極低的香氣閾值（0.021 μg/L）而成為多種茶類的特征性成分，并且它可與紅茶中的非揮發性物質發生協同作用，促進紅茶產生甜味，是紅茶中的典型甜味增強劑［19］。此外，二甲基硫醚是綠茶中重要的頭香物質，呈現煮玉米的清香，其在水中的香氣閾值僅為0.3 μg/L。研究表明S-甲基蛋氨酸鹽作為二甲基硫醚的前體物質，在綠茶干燥和沖泡過程中發生劇烈熱降解反應，產生大量二甲基硫醚。而萎凋和揉捻過程中S-甲基蛋氨酸鹽的含量持續增加，為后續生成二甲基硫醚積累了大量前體物質［20］。值得一提的是，雖然部分物質在滇綠茶香氣中的含量不高，但它們在水中的香氣閾值較低，因此在低濃度下也能表現出顯著的香氣。如呈煮蘋果味的β-大馬士酮的香氣閾值僅為0.006 μg/L，散發濃郁的油脂香和魚油香的（E）-4-庚烯醛的香氣閾值僅為0.008 7 μg/L，兩者卻是綠茶的特征性成分［8］。另外，滇綠茶中部分相對含量平均值高于0.05%的雜環類化合物（如呈茶香的茶吡咯；散發樟腦香的吲哚，閾值為11 μg/L；呈現塑料和皮革味的2-乙基呋喃，閾值為17 μg/L）可能對滇綠茶的香氣品質有一定貢獻。

綜合傳統感官審評、定量描述性分析、GC-O 嗅聞以及相對定量分析結果，滇綠茶的關鍵香氣成分包括呈花果香的芳樟醇、二氫芳樟醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、香葉基丙酮、月桂烯、茉莉酮、檸檬烯和β-大馬士酮，呈清香的二甲基硫醚、3-甲基丁醛、別羅勒烯、己醇和水楊酸甲酯，呈奶香的2，3-辛二酮，呈杏仁味的苯甲醛以及呈烘烤香的6-甲基-5-庚烯-2-酮。

3 結 論

本研究采用HS-SPME/GC-MS/O 技術分析了滇綠茶的香氣成分，通過總離子流圖及色譜峰對比，完成了包括脂肪烴和芳香烴、醇、醛、酮、酯、酚、雜環化合物、含硫化合物等在內的83種共有化合物的定性及相對定量分析。含量較高以及香氣強度較高的化合物有二甲基硫醚、3-甲基丁醛、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、檸檬烯、芳樟醇、β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮、二氫芳樟醇、水楊酸甲酯等，主要呈現玉米香、青草香、麥芽香、柑橘香和花香等香氣特點，對滇綠茶的花果香、甜香和清香等愉悅的香氣屬性具有重要貢獻作用，是滇綠茶的關鍵香氣成分。相對含量不高的低閾值化合物（如吲哚、茉莉酮、香葉醇、β-大馬士酮、烯醛類化合物等）也可能是形成滇綠茶的關鍵香氣物質，今后研究將重點關注這部分化合物。

茶葉香氣的形成和揮發受茶樹品種、生長環境和加工過程等多種因素的影響［2，21-22］。不同茶樹品種中與茶葉香氣形成有關的氨基酸、糖類、蛋白質及多酚等含量不同［23］；不同生長環境的茶葉的香氣存在差異，如高山茶園在高海拔條件下，蛋白質、氨基酸以及芳香物質的形成較多，而糖類含量較少［23］；用同一種鮮葉原料制作的名優綠茶的香氣成分含量因制作工藝不同而表現出明顯的香型差異［18，24］。干燥后，茶葉中低沸點的具有青草氣味的醇類和醛類物質繼續減少，而有利于綠茶香氣的具有清香或花香的酯類等成分的含量大幅增加［18］。在貯藏過程中，酯類物質逐漸水解，使茶葉產生陳氣；芳香物質中某些烴基化合物與氨基酸進行縮合變化，使具有鮮爽感的主要香氣成分的含量降低，導致香氣“滯鈍”而缺乏鮮爽感［25-26］。本研究對26 種滇綠茶進行總離子流圖對比，發現滇綠茶揮發性成分的種類和含量差異較大，后續研究將重點區分香氣成分的可能影響因素（如茶樹品種、采摘嫩度、采摘季節、加工工藝及參數等），以期為滇綠茶實際生產提供理論指導。