外周血CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞對(duì)膿毒癥診斷的價(jià)值評(píng)估

陳國(guó)昇,文大林,種慧敏,張 鵬,杜 娟,楊 堃,張可珺,鄧 進(jìn),張安強(qiáng)

1.安順市人民醫(yī)院泌尿外科,貴州 安順 561000; 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院,創(chuàng)傷與化學(xué)中毒全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科,貴陽(yáng) 550004; 4.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400042; 5.重慶市渝北區(qū)中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,重慶 401121

膿毒癥被定義為因宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命器官功能障礙[1]。最近的一份全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告強(qiáng)調(diào),全球每年有將近5 000萬(wàn)人發(fā)生膿毒癥[2]。目前認(rèn)為在膿毒癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中同時(shí)存在不平衡的過(guò)度炎癥和免疫抑制,而大多數(shù)患者的預(yù)后不良與嚴(yán)重的免疫抑制有關(guān)[3]。膿毒癥患者的免疫抑制涉及不同的細(xì)胞類型和特征,與免疫細(xì)胞凋亡增強(qiáng)、T細(xì)胞衰竭、通過(guò)表觀遺傳變化使細(xì)胞重編程、激活細(xì)胞表面分子的表達(dá)減少等有關(guān)[4]。Pauken和Wherry[5]研究表明T淋巴細(xì)胞耗竭是膿毒癥患者發(fā)生免疫抑制的主要特征。因此早期動(dòng)態(tài)檢測(cè)膿毒癥患者T細(xì)胞亞群的變化,監(jiān)測(cè)和評(píng)估膿毒癥患者的免疫功能狀態(tài),及時(shí)診斷和評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度,對(duì)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層,有利于及時(shí)采取措施以改善膿毒癥的預(yù)后。

CD8+T淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,可殺滅靶細(xì)胞及帶有特異性抗原的細(xì)胞,促進(jìn)抗體合成及T淋巴細(xì)胞增殖過(guò)程,是人體體液免疫與細(xì)胞免疫的重要調(diào)節(jié)者,對(duì)于保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[6],并且CD8+記憶T細(xì)胞亞群在對(duì)抗膿毒癥患者二次感染中發(fā)揮重要作用[7]。雖然在膿毒癥的臨床與基礎(chǔ)研究中對(duì)CD8+T細(xì)胞的研究較多,但是對(duì)CD8+T細(xì)胞亞群在膿毒癥中的作用研究較少。因?yàn)閺哪摱景Y發(fā)生開始,便同時(shí)存在免疫功能亢進(jìn)及免疫抑制[3],因此本研究的觀察時(shí)間點(diǎn)選擇在患者因膿毒癥入ICU第1、3、5天,并通過(guò)檢測(cè)危重癥患者外周血CD8+T細(xì)胞亞群的變化,評(píng)估其用于膿毒癥診斷的價(jià)值。

資料與方法

1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲入住ICU;(2)膿毒癥的診斷基于Sepsis-3標(biāo)準(zhǔn)[1]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有自身免疫性疾病、腫瘤或免疫缺陷;(2)患有艾滋病毒、肝炎和梅毒等傳染病;(3)孕婦和哺乳期。

前瞻性選擇2021年3月—2022年3月陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院ICU收治的符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的膿毒癥和非膿毒癥各30例患者作為研究對(duì)象。其中男性40例,女性20例;年齡29～70歲,平均55.4歲。其中創(chuàng)傷患者16例(道路交通傷7例,高處墜落傷5例,擠壓傷3例,銳器傷1例)。膿毒癥患者感染來(lái)源:肺部感染7例、腹部感染11例、血液感染3例、泌尿系感染6例、其他感染3例。患者分類見(jiàn)表1。本研究已通過(guò)陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-137)。

表1 兩組患者疾病分類(n)

2 研究方法

本研究樣本采集自陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院ICU,由安順市人民醫(yī)院、貴州醫(yī)科大學(xué)和陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院的研究人員完成指標(biāo)檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集和分析。從臨床電子醫(yī)療系統(tǒng)收集患者臨床資料,包括患者原發(fā)疾病以及基本信息、感染部位、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)以及現(xiàn)有臨床狀態(tài)和疾病嚴(yán)重程度并進(jìn)行分析。患者疾病嚴(yán)重程度由APACHE Ⅱ評(píng)分和序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment,SOFA)進(jìn)行評(píng)估。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者入ICU第1、3、5天CD8+T細(xì)胞各亞群比例,收集血漿降鈣素原(procalcitonin,PCT)、CRP及IL-6的臨床化驗(yàn)結(jié)果,并分析上述指標(biāo)在各組間的差異、與膿毒癥發(fā)生的關(guān)系、各指標(biāo)對(duì)膿毒癥的診斷效能以及與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

2.1樣本采集 對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的危重癥患者,以連續(xù)采血的方式,分別于入ICU后第1、3、5天用乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)抗凝真空管采集外周全血2 mL,混勻后室溫放置待用。

2.2CD8+T細(xì)胞亞群比例的檢測(cè) 各細(xì)胞免疫指標(biāo)選擇不同熒光直接標(biāo)記的抗體(美國(guó)Beckman Coulter公司)與對(duì)應(yīng)指標(biāo)分子特異性結(jié)合,通過(guò)Navios多通道流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè)患者外周血細(xì)胞CD45、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197表達(dá)水平,所有血液樣本在采集后2 h內(nèi)完成檢測(cè)。使用Kaluza流式分析軟件分析 CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及其亞群的比例,主要有初始CD8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T淋巴細(xì)胞、中央記憶CD8+T淋巴細(xì)胞。比較上述各細(xì)胞亞群在患者入ICU第1、3、5天的變化規(guī)律,分析其在膿毒癥與非膿毒癥患者中的表達(dá)差異,研究其與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 危重癥患者基線資料以及膿毒癥患者與非膿毒癥患者PCT、CRP及IL-6水平比較

膿毒癥患者入ICU第3天的SOFA顯著高于非膿毒癥患者(P=0.048),第1天及第5天比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。APACHE Ⅱ評(píng)分在第1、3、5天比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),組別、時(shí)間主效應(yīng)以及組別與時(shí)間交互效應(yīng)均不顯著(P>0.05)。膿毒癥患者入ICU第1、3、5天的PCT及第1天CRP水平明顯高于非膿毒癥患者(P均<0.05),第3天及第5天CRP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1、3、5天IL-6比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其中CRP組別主效應(yīng)顯著(P=0.034),PCT組別、時(shí)間主效應(yīng)以及組別與時(shí)間交互效應(yīng)均顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者基線資料比較

2 膿毒癥患者與非膿毒癥患者T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞亞群的變化

入ICU第1、3、5天膿毒癥患者的CD3+T細(xì)胞比例、CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM)比例顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05);第3天CD4+T細(xì)胞亞群比例以及CD8+Naive T細(xì)胞比例顯著高于非膿毒癥患者(P均<0.05),余指標(biāo)在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。其中CD3+T細(xì)胞比例組別主效應(yīng)顯著(P<0.001),CD4+T細(xì)胞比例時(shí)間主效應(yīng)顯著(P=0.022),CD8+TEM細(xì)胞比例組別主效應(yīng)顯著(P<0.001),CD8+Naive T細(xì)胞比例組別主效應(yīng)顯著(P=0.020)。見(jiàn)表3。

表3 膿毒癥患者CD8T細(xì)胞亞群表達(dá)變化

3 危重癥患者發(fā)生膿毒癥的危險(xiǎn)因素分析

建立Logistic回歸模型,以發(fā)生膿毒癥為因變量,以性別和年齡作為校正因素,進(jìn)行單因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,入ICU第1天CD3+T細(xì)胞亞群比例、CD8+TEM比例、PCT以及CRP均與膿毒癥發(fā)生顯著相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表4。將上述4個(gè)指標(biāo)納入多因素邏輯回歸分析,結(jié)果顯示CD8+TEM比例以及CRP為膿毒癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 單因素Logisitic 回歸分析患者入ICU第1天發(fā)生膿毒癥的危險(xiǎn)因素

表5 多因素Logisitic 回歸分析患者入ICU第1天發(fā)生膿毒癥的危險(xiǎn)因素

4 膿毒癥診斷效能分析

在膿毒癥診斷中CRP、CD3+T細(xì)胞、CD8+TEM及PCT的AUC(95%CI)分別為:0.772(0.646～0.871)、0.737(0.608～0.842)、0.795(0.665～0.892)、0.851(0.736～0.930),后兩者聯(lián)合診斷膿毒癥的AUC為0.890(0.775～0.959)。見(jiàn)圖1。

PCT:降鈣素原;CD8+TEM:CD8效應(yīng)記憶T細(xì)胞

討 論

膿毒癥的特征是對(duì)全身感染的過(guò)度免疫反應(yīng),導(dǎo)致炎癥失控、血管功能障礙、急性淋巴細(xì)胞減少和長(zhǎng)期免疫麻痹。因此早期監(jiān)測(cè)膿毒癥患者免疫功能,判斷患者免疫抑制狀態(tài),準(zhǔn)確評(píng)估患者病情,及時(shí)做出診斷,以指導(dǎo)臨床治療,對(duì)改善膿毒癥患者預(yù)后至關(guān)重要。而生物標(biāo)志物的應(yīng)用有效增加了膿毒癥診斷及預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。為此筆者檢測(cè)了膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中免疫細(xì)胞亞群的改變,尤其是T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化,來(lái)探尋對(duì)膿毒癥的診斷以及患者病情評(píng)估的新的高敏感性及特異性指標(biāo)。

研究證實(shí),膿毒癥患者免疫抑制的主要特征是T細(xì)胞耗竭,其表現(xiàn)為T細(xì)胞增殖降低、細(xì)胞因子分泌能力下降且易于凋亡[5,8]。在膿毒癥患者中,由于發(fā)生免疫穩(wěn)態(tài)失衡,尤其是淋巴細(xì)胞持續(xù)減少的患者,其病死率顯著高于其他患者,使得淋巴細(xì)胞絕對(duì)值減少成為評(píng)估持續(xù)免疫抑制及不良預(yù)后的重要指標(biāo)[9]。在本研究中,膿毒癥患者在入ICU第1、3、5天的T細(xì)胞比例均顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05),提示膿毒癥患者處于嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)。Logistic回歸分析顯示T細(xì)胞的降低與膿毒癥的發(fā)生顯著相關(guān),其對(duì)膿毒癥的診斷的AUC為0.737(0.608～0.842),有較好的效能。所以了解T細(xì)胞在患者發(fā)生膿毒癥之后的變化,可以更加全面地了解膿毒癥患者的免疫狀態(tài),更有效地指導(dǎo)臨床特異性的治療。

在感染發(fā)生后,抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別,初始T細(xì)胞迅速分化為效應(yīng)T細(xì)胞,大多數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞遷移至感染部位來(lái)對(duì)抗病原體[10]。而在感染清除后大部分效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生死亡,有一部分分化為記憶T細(xì)胞[11]。記憶T細(xì)胞被分為兩群即TCM和TEM,前者在宿主體內(nèi)存活的時(shí)間較長(zhǎng),但在病原體再次感染時(shí),后者能更迅速地發(fā)揮作用[12]。記憶性CD8+T細(xì)胞群一旦形成,就可以維持到宿主的整個(gè)生命周期,這些細(xì)胞提供了對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染的保護(hù),并介導(dǎo)抗腫瘤免疫[13],并且其部分亞群與膿毒癥的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[14]。在本研究中,筆者主要發(fā)現(xiàn)CD8+TEM在第1、3、5天的比例顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05)。Logistic回歸分析顯示CD8+TEM細(xì)胞比例降低與膿毒癥發(fā)生顯著相關(guān),其對(duì)膿毒癥診斷的AUC為0.795(0.665～0.892),有較好的效能,因此CD8+TEM細(xì)胞亞群的比例可以作為膿毒癥診斷的一個(gè)新指標(biāo),以期為膿毒癥患者的診療提供有用的幫助。

CRP和PCT均是機(jī)體應(yīng)對(duì)感染和損傷時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì),后者在臨床上被用作最常用的感染診斷指標(biāo),尤其是在患者發(fā)生膿毒癥后迅速升高,對(duì)膿毒癥的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值[15]。在本研究中,PCT在膿毒癥患者中的表達(dá)顯著升高,其對(duì)膿毒癥的診斷效能為0.851(0.736～0.930),其與CD8+TEM細(xì)胞亞群聯(lián)合后,對(duì)膿毒癥的診斷效能顯著提高,AUC為0.890(0.775～0.959),明顯高于其他單個(gè)指標(biāo)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CD8+TEM細(xì)胞亞群可以作為膿毒癥診斷、評(píng)估患者免疫功能以及判斷疾病嚴(yán)重程度的新指標(biāo)。但是本研究也存在幾點(diǎn)不足之處:(1)單中心小樣本量研究,限制了普遍性;(2)雖然動(dòng)態(tài)地研究了T細(xì)胞亞群,但是沒(méi)有繼續(xù)進(jìn)行遠(yuǎn)期監(jiān)測(cè)。希望本次研究結(jié)果能在更大的隊(duì)列研究中進(jìn)行驗(yàn)證,以期為膿毒癥的臨床診療提供支持。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳國(guó)昇:論文撰寫、數(shù)據(jù)分析、資料采集;文大林、種慧敏:實(shí)施研究、資料采集;張鵬、杜娟:分析數(shù)據(jù);楊堃、張可珺:技術(shù)支持;鄧進(jìn):設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn);張安強(qiáng):設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、獲取研究經(jīng)費(fèi)、文章修改