蓮草直胸跳甲短神經(jīng)肽F 受體基因sNPFR的克隆及表達分析

王康　趙雪瑩　霍楠　胡軍　王苑馨　楊軍　賈棟

摘要：為明確蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）短神經(jīng)肽F 受體AhsNPFR 功能及其表達特點，為探索蓮草直胸跳甲生防作用奠定理論基礎，利用PCR 技術克隆鑒定蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因并進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR 技術分析其在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時期和組織中的時空表達譜。結果表明，克隆獲得基因AhsNPFR 全長1 669 bp，開放閱讀框1 257 bp，編碼418 個氨基酸；預測其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為48.11 ku，理論等電點為8.21，AhsNPFR 具有7 個典型保守跨膜結構域，屬于GPCRs 家族，系統(tǒng)進化樹分析表明，其與玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera sNPFR 親緣關系最近。AhsNPFR 基因在不同發(fā)育階段均有表達，在1 齡幼蟲中的表達量最高，是卵中表達量的9.06 倍；在卵中表達量最低；雌成蟲的表達量顯著高于雄成蟲。AhsN ?PFR 基因在不同組織中均有表達，在3 齡幼蟲后腸中顯著高表達，是脂肪體表達量的12.21 倍；在雌雄成蟲后腸顯著高表達，并在所有組織中均沒有雌雄表達差異。

關鍵詞：蓮草直胸跳甲；短神經(jīng)肽F 受體基因sNPFR；基因克隆；發(fā)育時期表達；組織表達

中圖分類號：S476.2文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）01?0137?08

神經(jīng)肽是一類重要的信號分子，在昆蟲的生長發(fā)育、繁殖和行為等多種生物學過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。昆蟲神經(jīng)肽作為配體通過與同源的G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）相互作用介導其生物學功能[2]。短神經(jīng)肽F（shortneuropeptide F，sNPF）是最初通過神經(jīng)肽F（neuro?peptide F，NPF）C 末端抗體在馬鈴薯甲蟲Leptino?tarsa decemlineata 和沙漠蝗蟲Schistocerca gregaria中鑒定得到的一類NPF 短肽[3-4]，這些NPF 短肽僅由8～10 個氨基酸組成，而不是無脊椎動物NPF 典型的36～40 個氨基酸[5]，基于其羧基末端的RLRF酰胺序列類似于無脊椎動物的NPF 的RPRF 基序[6]，因此，命名為sNPF。

與大多數(shù)神經(jīng)肽信號系統(tǒng)相同，sNPF 也是通過激活其特異性短神經(jīng)肽F 受體（short neuropep?tide F receptor，sNPFR），進而引發(fā)細胞信號傳導機制發(fā)揮系列功能[7]。sNPFR 首次在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在紅火蟻Solenopsis invicta 和岡比亞按蚊Anopheles gambiae 中相繼克隆出來[9-10]。sNPF 信號系統(tǒng)在昆蟲的晝夜節(jié)律[11]、生長發(fā)育[12]、寄主定位[13-14]、取食等生理過程中發(fā)揮重要作用，尤其在昆蟲取食中的調(diào)控作用引起相關研究者的廣泛關注。在黑腹果蠅Drosophila melanogaster 中，DmsNPF及其受體DmsNPFR 的表達能促進取食量增加及體型增大，相反RNA 干擾二者的功能后果蠅的取食量減少且體型變小[15-16]。華山松大小蠹Dendrocto?nus armandi 中敲除DasNPF 及其受體DasNPFR后，幼蟲和雌雄成蟲的取食量均減少[17]。與上述昆蟲相反，在沙漠飛蝗S. gregaria 中，SgsNPF 及其受體SgsNPFR 的敲除反而會導致取食量增加[18-19]。大量研究表明，昆蟲頭部和腸道是sNPFR 的主要表達部位，但在其他組織部位如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（cen?tral nervous system，CNS）、觸角、脂肪體、馬氏管等也都有表達[10，17，20]，關于sNPFR 的表達部位目前還沒有明確結論。

蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila 是世界惡性雜草喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides 的專食性天敵昆蟲[21-23]。本研究擬基于神經(jīng)肽sNPF信號系統(tǒng)與昆蟲的寄主定位及取食密切相關的特性，克隆鑒定蓮草直胸跳甲sNPF 信號系統(tǒng)的sNPFR 基因，檢測其在不同發(fā)育階段及組織的表達模式，旨在為后續(xù)深入研究蓮草直胸跳甲專一性定位寄主與取食的分子調(diào)控機制提供理論基礎。

1材料和方法

1.1 試驗材料

供試蓮草直胸跳甲采自華南農(nóng)業(yè)大學，后飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學生物安全與生物防治實驗室養(yǎng)蟲室。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃ ，相對濕度為85%±5%，光周期14L∶10D。幼蟲飼養(yǎng)于玻璃培養(yǎng)皿（直徑15 cm，高2.5 cm），成蟲飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲罐（直徑12 cm，高17 cm）。

喜旱蓮子草采自浙江省玉環(huán)縣，現(xiàn)種植于太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學生物安全與生物防治基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 昆蟲樣品收集

基因克隆樣品為蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的混合樣本。各發(fā)育階段的取樣分別為：1 日齡卵，1 日齡的1、2、3 齡幼蟲，1 日齡蛹和雌雄成蟲。其中，3 齡幼蟲組織的取樣為：頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體；雌雄成蟲取樣為：觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體。以上樣本均3 次生物學重復，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA 的提取與cDNA 合成

總RNA 使用Trizol 試劑（TaKaRa，大連）提取，通過超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop，Cambridge，UK）測定濃度，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。以1 μg RNA 為模板，采用HiScript? Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）的步驟合成cDNA 第1 鏈，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 AhsNPFR 的克隆鑒定與序列分析

基于課題組的蓮草直胸跳甲轉錄組數(shù)據(jù)[24]，利用Primer5.0 設計目的基因的擴增引物（表1），以1.2.2 合成cDNA 為模板，利用Phanta? Max Super-FidelityDNA Polymerase 試劑盒（Vazyme，南京）進行PCR擴增。PCR 反應體系為：2×Phanta Max Buffer10 μL，引物AhsNPFR-F/AhsNPFR-R 各0.8 μL，1 ? cDNA 1 μL，Phanta MAX Super-Fidelity DNApolymerase 0.5 μL，dNTP Mix 0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，48 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；徹底延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過M5 Gel Extraction Kit（Mei5bio，Beijing，China）進行回收，連接于pEASY?-Blunt3 CloningVector（Trans Gen Biotech，北京），轉入TOP10 感受態(tài)細胞（ANGYUBIO，上海），菌液送上海生工生物工程有限公司測序。

利用NCBI ORF（Open Reading Frame）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預測AhsNPFR 基因的開放閱讀框，DNAMAN 進行多序列比對，ExPASy-ProtParam（http：//web. expasy. org/prot?param/）預測等電點及蛋白質(zhì)分子量大小，DeepT?MHMM（https：//dtu. biolib. com/DeepTMHMM）預測跨膜結構域，InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）預測保守結構域與蛋白家族。通過MEGA 7.0 采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復1 000 次。

1.2.4 AhsNPFR 基因的表達模式分析

以1.2.2合成cDNA 為qPCR 模板，通過BeaconDesign 7.0設計AhsNPFR 特異性引物，以18S 核糖體蛋白（RPS18）[25]作為不同發(fā)育階段和不同組織處理的內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR（表1）。qPCR 所使用的儀器為ABI7500（Applied Biosystems，F(xiàn)os?ter City，CA，USA）。反應體系為：2?ChamQ Uni?versal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，10 ? cDNA 1 μL，加ddH2O 至20 μL。qPCR 反應條件為：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。不同發(fā)育階段和各組織樣品分別設置3 次生物學重復和3 次技術重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

qPCR 相對表達量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt[26]法進行分析，使用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey?s HSD 進行多重比較差異分析，差異顯著性標準為P<0.05。所得結果采用平均值± 標準誤表示，柱狀圖均由GraphPadPrism 8 繪制。

2結果與分析

2.1 AhsNPFR 基因克隆鑒定

克隆獲得了1 個短神經(jīng)肽受體基因，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預期長度一致的目的片段（圖1），其開放閱讀框ORF 長1 257 bp，編碼418 個氨基酸（圖2），命名為AhsNPFR（Gen?Bank 登錄號為OQ550102）。

2.2 序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為48.11 ku，等電點（pI）為8.21；結構域預測顯示，在38—297 位氨基酸殘基之間具有GPCRs 家族的保守結構域，屬于GPCRs 家族；多序列比對結果（圖3）顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 氨基酸序列與其他5 種鞘翅目昆蟲的sNPFR 序列相似性最高，為72.15%～87.22%，其中，與玉米根螢葉甲Di?abrotica virgifera virgifera 相似性最高（87.22%），與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyx mori 相似性次之（52.34%），與雙翅目昆蟲黑腹果蠅D. melanogaster相似性最低（38.83%）。根據(jù)與其他昆蟲sNPFR共有的7 個典型保守跨膜結構域，克隆序列應該為AhsNPFR 基因。

將蓮草直胸跳甲sNPFR 氨基酸序列與鞘翅目、鱗翅目、雙翅目和半翅目等其他26 種昆蟲進行多序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4 所示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 與其他鞘翅目昆蟲聚為一支；其中與玉米根螢葉甲DvsNPFR、光肩星天牛AgsNPFR 和馬鈴薯甲蟲LdsNPFR 親緣關系較近；其他目昆蟲也能分別聚類，符合分類學關系。

2.3 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段內(nèi)的表達水平。結果表明，AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲各發(fā)育階段均有表達，其中幼蟲期（1～3 齡幼蟲）和成蟲期（雌雄成蟲）的表達量均顯著高于卵期和蛹期（P<0.05），1、3 齡幼蟲表達量顯著高于2 齡幼蟲，雌成蟲表達量顯著高于雄成蟲（P<0.05）。AhsNPFR 在1～3 齡幼蟲、蛹、雌、雄成蟲的相對表達量分別是卵期AhsNPFR表達量的9.05 倍、6.16 倍、8.03 倍、3.20 倍、8.84 倍和5.55 倍（圖5）。

2.4 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同組織的表達模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲不同組織的表達水平，結果表明（圖6），AhsNPFR 基因在3 齡幼蟲各組織均有表達，其中后腸的表達量最高，顯著高于其他組織，是脂肪體表達量的12.21 倍（P<0.05）；在頭、前腸、中腸和馬氏管的表達量間沒有顯著差異（P>0.05）；在脂肪體的表達量最低。

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲不同組織的表達水平，結果表明（圖7），AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲各個組織均有表達，且表達模式相似，后腸的表達量均顯著高于其他組織（P<0.05）；觸角、頭、前腸、中腸、馬氏管、脂肪體的表達量沒有顯著差異，雌雄成蟲相同組織中表達量差異不顯著（P>0.05）。

3結論與討論

本研究克隆了蓮草直胸跳甲sNPFR 基因全長序列，其開放閱讀框編碼418 個氨基酸殘基，具有GPCRs 家族的保守結構域。目前，已鑒定的節(jié)肢動物短神經(jīng)肽受體sNPFR 均屬于GPCRs 家族[18]，主要典型特征為含有7 個跨膜結構域。本研究結果顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 也含有7 個跨膜結構域，并且與其它昆蟲sNPFR 的保守結構域高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明該基因可用于物種的進化關系研究。

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因在幼蟲和成蟲期的表達量顯著高于卵和蛹期，1 齡幼蟲表達量最高。有研究表明，在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum 中，ApsNPFR 在若蟲和成蟲中都有表達，且1 齡若蟲表達量最高，敲除ApsNPFR 后，刺探電位圖譜（EPG）結果顯示，豌豆蚜A. pisum 刺吸植物的次數(shù)和刺吸時間顯著減少[27]。在黑腹果蠅中，DmsNPFR的過表達導致取食量增加[16]。由此可見，sNPFR 在調(diào)控昆蟲取食中發(fā)揮重要功能作用，蓮草直胸跳甲是喜旱蓮子草的專食性天敵昆蟲，我們推測，AhsNPFR 也可能與蓮草直胸跳甲取食密切相關，但其功能還需后續(xù)基因干擾及行為試驗驗證。另外發(fā)現(xiàn)，蓮草直胸跳甲雌成蟲AhsNPFR 表達量顯著高于雄成蟲，相關結果在其它文獻未見報道，推測可能為蓮草直胸跳甲雌成蟲取食量高于雄成蟲的重要分子基礎。

AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲和雌雄成蟲后腸中顯著高表達。有研究表明，在華山松大小蠹D. armandi 中，DasNPFR 基因在頭和中腸組織中顯著高表達，功能驗證表明其主要與取食相關[17]。在橘小實蠅Bactrocera dorsalis 中，BdsN ?PFR 在觸角和中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯著高表達，通過CRISPR/Cas9 敲除BdsNPFR，發(fā)現(xiàn)該蟲定位寄主能力變?nèi)酰籈AG 反應中，對3 種氣味物質(zhì)的電生理反應均顯著降低[28]。家蠶B. mori sNPF 的3 個同源受體（BNGR-A7、BNGR-A10 和BNGR?A11）在不同組織中表達模式不同，其中BNGR?A7 僅在成蟲頭部高表達，BNGR?A10 在幼蟲和蛹的馬氏管中高表達，而在成蟲馬氏管中表達量較低，BNGRA11在幼蟲和成蟲的馬氏管、中腸和精巢中表達量較高，而在蛹期的卵巢中相對表達量較高[20]。由此可見，短神經(jīng)肽受體sNPFR 在不同昆蟲的調(diào)控模式可能不同。本研究中檢測了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管和脂肪體的表達情況，但仍有不足。有文獻報道，sN ?PFR 在昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯著高表達[27]，由于技術原因，沒有檢測AhsNPFR 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS中的表達情況。

本研究克隆鑒定了蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因，明確了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時期和不同組織的表達模式，為進一步解析短神經(jīng)肽受體AhsNPFR 調(diào)控蓮草直胸跳甲的取食調(diào)控機制奠定依據(jù)，也為蓮草直胸跳甲生防世界惡性雜草喜旱蓮子草提供一些新的思路。

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