HPLC多指標成分聯合PCA、OPLS-DA及灰色關聯度法的宮瘤消膠囊綜合質量評價*

張希冉，貢磊磊，李軼凡，秦春雨，王志軍

（1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院，北京 100026；2.河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200）

宮瘤消膠囊（GLX）由黨參、白花蛇舌草、牡丹皮、香附和莪術等中藥經滲漉等加工工藝制備而成，現行標準為國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-11329（ZD-1329）-2002-2011Z[1]。GLX具有活血化瘀、軟堅散結之功效，用于子宮肌瘤屬氣滯血瘀證，證見：月經量多，夾有大小血塊，經期延長，或有腹痛，舌暗紅，或邊有紫點、瘀斑，脈細弦或細澀。目前質量標準及相關文獻[2-3]僅以單一成分為定量指標，不能滿足中藥現代化發展的需要，更不能保證產品質量及臨床療效。化學計量學[4-5]方法可通過對多成分的定量測定結果進行提取和降維，挖掘復雜數據間存在的內在關聯關系，找出對質量控制具有顯著貢獻的主要成分。灰色關聯度分析（GRA）法[6]基于灰色系統的灰色過程，根據各因素數列曲線形狀相似程度進行發展態勢分析，對各指標的綜合評判值進行直觀地表達，避免了用多個指標對其綜合評判值的人為判斷。本實驗采用HPLC法同時檢測GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的含量，運用化學計量學和GRA法對多組分定量檢測數據進行分析挖掘，并通過SPSS 26.0和SIMCA 14.1統計學軟件對其進行綜合質量評價，以期為GLX的整體質量控制提供實驗數據。

1 儀器與試藥

丹皮酚（批號：110708-201908，含量以99.8%計）、莪術醇（批號：100185-201908，含量以99.9%計）、α-香附酮（批號：110748-202117，含量以99.8%計）、莪術二酮（批號：111800-202203，含量以99.8%計）、芍藥苷（批號：110736-202246，含量以96.7%計）和紫丁香苷（批號：111574-202106，含量以94.3%計）由中國食品藥品檢定研究院提供；氧化芍藥苷（批號：14062505，含量以99.9%計）、雞矢藤次苷甲酯（批號：PRF8091244，含量以99.6%計）和車葉草苷酸（批號PRF8050928，含量以98.2%計）由成都普瑞法科技開發有限公司提供；黨參炔苷（批號：CFS202201，含量以98.5%計）、車葉草苷（批號：CFS202102，含量以98.2%計）、香附烯酮（批號：CFS202101，含量以98.5%計）和圓柚酮（批號：CFS202201，含量以98.4%計）由武漢天植生物技術有限公司提供；15批GLX（規格：每粒0.5g，批號：221202，221104，221103，221102，221002，220907，220603，220602，220601，220502，211205，211204，211203，211201，211104，編號分別為S1～S15）來源于山東步長神州制藥有限公司；乙腈（色譜級，天津市康科德科技有限公司）、磷酸（色譜級，美國Tedia公司），其余試劑為分析純。

KQ-300DV型超聲波清洗器（廣州穎漢科技有限公司）；Agilent 1200型HPLC儀（美國安捷倫科技公司）；AB104.N型電子天平（上海托利-梅特勒儀器有限公司）；色譜柱（規格250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikmatech Diamonsil Plus C18柱）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品 精密稱取黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇對照品各適量，用50%甲醇制成含黨參炔苷（0.192 mg/mL）、紫丁香苷（0.036 mg/mL）、雞矢藤次苷甲酯（0.590 mg/mL）、車葉草苷酸（0.414 mg/mL）、車葉草苷（0.530 mg/mL）、氧化芍藥苷（0.318 mg/mL）、芍藥苷（0.452 mg/mL）、丹皮酚（0.940 mg/mL）、香附烯酮（0.374 mg/mL、）圓柚酮（0.042 mg/mL）、α-香附酮（0.176 mg/mL）、莪術二酮（0.252 mg/mL）和莪術醇（0.118 mg/mL）的混合母液。精密量取混合母液，用50%甲醇稀釋20倍，即得。

2.1.2 供試品 取10粒GLX內容物，混勻，研細，取細粉約1.0 g，精密稱定，經50%甲醇超聲提取30 min，放冷，定容至25 mL，搖勻，過濾，取續濾液，備HPLC檢測用。取按質量標準分別制備的缺黨參、缺白花蛇舌草、缺牡丹皮、缺香附和缺莪術的陰性對照品，再依上法制成5個陰性對照品溶液，備HPLC檢測用。

2.2 色譜條件及專屬性試驗 采用Dikmatech Diamonsil Plus C18色譜柱，流動相乙腈（A）-0.1%磷酸[7-10]梯度洗脫（0～9 min，17.0%A；9 ～17 min，17.0%→30.0%A；17 ～31 min，30.0%→33.0%A；31 ～45 min，33.0%→55.0%A；45 ～59 min，55.0%→65.0%A；59 ～71 min，65.0%→75.0%A；71 ～75 min，75.0%→17.0%A）；檢測波長為254 nm[11-13]（0～27 min，黨參炔苷和紫丁香苷）、235 nm[14-20]（27～38 min，雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮）和214 nm[21-22]（38～65 min，莪術二酮和莪術醇）；柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。混合對照品、供試品溶液色譜圖見圖1。結果GLX供試品中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇色譜峰的保留時間與對照品一致，且峰形尖銳，無雜質峰干擾。

圖1 混合對照品（A）、GLX（B）、黨參陰性對照品（C）、白花蛇舌草陰性對照品（D）、牡丹皮陰性對照品（E）、香附陰性對照品（F）和莪術陰性對照品（G）色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察用50%甲醇將上述對照品母液稀釋4、10、20、40、100和200倍，搖勻，依法檢測黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇色譜峰，以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行回歸處理，結果見表1。

表1 GLX 中13 種成分回歸處理結果

2.3.2 精密度、穩定性及重復性試驗 在“2.2”項色譜條件下，重復進樣同一份GLX（S1）供試品溶液6次，計算各成分峰面積的RSD值，結果黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇峰面積RSD值依次為1.46%、1.83%、0.96%、1.15%、1.05%、1.35%、1.13%、0.73%、1.23%、1.79%、1.52%、1.41%和1.56%。取同一份GLX（S1）供試品溶液（室溫存放），于制備后0、2、4、7、12、18、24和36 h進樣，測得黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇峰面積RSD值依次為1.69%、1.93%、1.37%、1.47%、1.54%、1.74%、1.54%、1.14%、1.35%、1.98%、1.73%、1.80%和1.88%，表明GLX供試品溶液36 h內穩定。取6份編號S1的GLX，各自按“2.1.2”項方法處理成供試品溶液，依法檢測，記錄峰面積，代入回歸方程，用外標法計算黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇含量，結果方法重復性良好，含量的RSD值依次為1.72%、1.98%、1.23%、1.48%、1.37%、1.59%、1.42%、1.02%、1.56%、1.92%、1.79%、1.67%和1.82%。

2.3.3 加樣回收率試驗 取已知13種成分含量編號S1的GLX內容物細粉9份，每份約0.5 g，精密稱定，隨機均分為3組，每組分別加入0.8、1.0、1.2 mL混合對照品溶液[黨參炔苷（0.107 mg/mL）、紫丁香苷（0.019 mg/mL）、雞矢藤次苷甲酯（0.398 mg/mL）、車葉草苷酸（0.311 mg/mL）、車葉草苷（0.372 mg/mL）、氧化芍藥苷（0.229 mg/mL）、芍藥苷（0.326 mg/mL）、丹皮酚（0.591 mg/mL）、香附烯酮（0.269 mg/mL）、圓柚酮（0.024 mg/mL）、α-香附酮（0.093mg/mL）、莪術二酮（0.152 mg/mL）和莪術醇（0.069 mg/mL）]，按“2.1.2”項方法制得加樣供試品溶液，低、中、高3個水平各平行3份，進樣檢測，得黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇平均加樣回收率分別為98.31%、96.81%、99.45%、97.89%、99.58%、98.65%、98.17%、100.10%、99.43%、96.91%、97.79%、97.95%和98.48%，RSD值分別為1.49%、1.44%、1.37%、1.46%、0.93%、1.24%、1.29%、0.86%、0.78%、1.48%、1.03%、1.20%和1.15%。

2.4 GLX樣品含量檢測 取15批GLX（S1～S15）依法制成的GLX供試品溶液，進樣，每批樣品檢測3次，記錄黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的峰面積，將13種成分峰面積代入“2.3.1”項回歸方程，計算其在樣品中的含量，結果見表2。

表2 15 批GLX 中13 種成分含量測定結果 （n=3）

2.5 GLX化學計量學質量評價

2.5.1 主成分分析（PCA） 將15批GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的含量數據導入SPSS 26.0軟件進行PCA，由PCA結果（表3~4）可知，前2個主成分的累積方差貢獻率為90.626%，其中主成分1的占比為74.364%。由載荷矩陣可知，主成分1的信息由紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、α-香附酮和莪術醇組成，黨參炔苷、圓柚酮和莪術二酮對主成分2貢獻度顯著。為驗證PCA的可信度，同時運用SIMCA 14.1軟件對表2數據建立PCA模型，同樣提取出2個主成分，其中R2X＝0.906，表明模型穩定可靠，進一步分析得15批GLX樣品PCA得分圖（見圖2）。由圖2可知S1～S6位于得分圖左上側，S7～S10位于得分圖左下側，S11～S15位于得分圖右下側，批次相近的聚在一起。

圖2 15 批GLX 的PCA 得分圖

表3 特征值、方差貢獻及累積貢獻率

表4 GLX 中13 種成分的載荷矩陣

2.5.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 為進一步比較GLX樣品組間質量，發挖類間關異標記物，將表2數據導入SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA，得OPLS-DA模型得分圖（見圖3），結果模型參數R2X＝0.906，R2Y＝0.878，Q2＝0.776，均大于0.5，表明模型穩定可靠、預測能力良好。對OPLS-DA模型進行200次置換檢驗，得置換檢驗圖（見圖4），結果截距R2＝0.072 2，Q2＝-0.454，同時各成分散點的R2和Q2值均低于最右側的R2和Q2值，由此表明OPLS-DA模型未過度擬合。根據模型變量重要性投影（VIP）圖（見圖5），以VIP>1為篩選標準，VIP值越大，對產品質量差異貢獻度越大，結果有8個成分的VIP值>1，VIP值從大到小依次為VIP莪術二酮=1.370 2、VIP香附烯酮=1.313 7、VIP丹皮酚=1.282 8、VIP車葉草苷=1.139 1、VIP黨參炔苷=1.119 1、VIP雞矢藤次苷甲酯=1.110 5、VIP芍藥苷=1.014 9、VIP氧化芍藥苷=1.014 4，其次成分4（車葉草苷酸）的VIP=0.995 7，接近1，對GLX質量也有一定的影響。故這9個成分可作為影響GLX產品質量的差異標志物。

圖3 15 批GLX 樣品OPLS-DA 模型得分圖

圖4 OPLS-DA 置換檢測結果圖

圖5 13 個測定指標的VIP 圖

2.6 GRA

2.6.1 原始數據矩陣規格化 參考文獻[23]采用均值變換法對表2中15批GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的含量數據規格化處理，處理后數據見表5。

表5 GLX 中13 種成分含量數據規格化處理結果

2.6.2 計算關聯系數 以表5中每一成分的最大值為最優參考序列，最小值為最差參考序列，結果最優參考序列為1.307 4、1.593 8、1.291 8、1.301 7、1.340 2、1.531 7、1.344 8、1.256 2、1.487 1、1.368 7、1.380 7、1.338 9和1.341 3，最差參考序列為0.613 8、0.437 0、0.754 5、0.757 7、0.660 7、0.571 2、0.735 3、0.749 1、0.5081、0.662 3、0.697 2、0.599 4和0.690 6。按文獻[23]參考序列關聯系數計算公式分別計算各成分與最優參考序列的關聯系數（見表6）以及與最差參考序列的關聯系數（見表7）。

表6 各評價單元與最優參考序列的關聯系數

表7 各評價單元與最差參考序列的關聯系數

2.6.3 計算相對關聯度關聯度為每一批次GLX樣品中各個成分關聯系數的平均值，按文獻[23]相對關聯度計算公式計算相對關聯度，結果與最優參考序列關聯度、與最差參考序列關聯度和相對關聯度具體數據見表8。一般相對關聯度介于0～1之間，數值越大，樣品綜合質量最優。15批GLX樣品相對關聯度0.330 2～0.606 8，S11~S15分別位于排名前5位，S1~S6位于排名中間位置，S7~S10位于排名后4位。

表8 15 批GLX 相對關聯度排序結果

3 討論

3.1 流動相選擇 本試驗考察了以乙腈為有機相，水、0.1%甲酸液、0.05%磷酸液、0.1%磷酸液、0.2%磷酸液為水相的流動相系統對GLX中的黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的響應值及分離效果。結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸液為流動相時，基線平穩，13種待測成分的檢驗用時短、峰形及峰純度最優，響應值最大。

3.2 指標組分選擇 GLX由牡蠣、香附（制）、三棱、莪術、土鱉蟲、仙鶴草、黨參、白術、白花蛇舌草、牡丹皮和吳茱萸11味中藥材配伍而成。方中牡蠣味咸、澀，性微寒，軟堅散結；香附味辛、微苦，性平，疏肝理氣，調經止痛，兩藥合用，行氣消癥，散結止痛，共為君藥。三棱、莪術、土鱉蟲破血逐瘀，消積止痛；黨參、白術補氣健脾，以資化源。各藥相伍，祛瘀不傷正，扶正不留瘀，共為臣藥。白花蛇舌草清熱解毒，消腫止痛，伍仙鶴草、牡丹皮清熱涼血，活血散瘀；佐少量吳茱萸溫中散寒，防止苦寒傷脾陽，共為佐使。本方諸藥相合，通補兼施，溫清并用，共奏活血化瘀、軟堅散結之功。本試驗遵循中藥質量標志物遴選原則，以君藥、臣藥和佐藥為研究對象，選取香附活性成分香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮，黨參代表性成分黨參炔苷和紫丁香苷，莪術主要成分莪術二酮和莪術醇，白花蛇舌草藥效成分雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷，以及牡丹皮特征成分氧化芍藥苷、芍藥苷和丹皮酚為指標成分。

3.3 質量評價結果分析 本試驗采用HPLC法同步檢測了GLX樣品中13種化學組分含量，方法操作便捷，線性回歸、精密度、重復性、穩定性及加樣回收率均符合《中華人民共和國藥典》要求，黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術二酮和莪術醇的含量分別為0.123～0.262 mg/g、0.017 ～0.062 mg/g、0.639 ～1.094 mg/g、0.482 ～0.828 mg/g、0.600 ～1.217 mg/g、0.242 ～0.649 mg/g、0.573 ～1.048 mg/g、0.929 ～1.558 mg/g、0.340 ～0.995 mg/g、0.030 ～0.062 mg/g、0.152～0.301 mg/g、0.171～0.382 mg/g、0.104～0.202 mg/g。從含量檢測結果來看，13種成分均存在一定差異，表明GLX多組分HPLC定量模式的應用對提升和穩定該制劑整體質量具有參考意義。以15批GLX樣品中13種成分含量為質量評價變量，分別建立了PCA和OPLS-DA模型，對復雜的多維數據進行了降維，挖掘篩選出莪術二酮、香附烯酮、丹皮酚、車葉草苷、黨參炔苷、雞矢藤次苷甲酯、芍藥苷、氧化芍藥苷和車葉草苷酸對GLX質量影響較大，是影響GLX產品質量的主要標記物。同時本研究采用GRA技術，建立了GLX樣品質量優劣評價模型，對評價對象進行質量排序，S11~S15分別位于排名前5位，相對關聯度由大到小依次為0.606 8、0.591 2、0.572 9、0.572 5和0.533 2，S7~S10位于排名后4位，相對關聯度由大到小依次為0.406 5、0.388 8、0.364 6和0.330 2，表明GRA模型可用于GLX樣品質量優劣評價。

本試驗所建立的HPLC多組分定量聯合PCA、OPLS-DA等化學計量學以及GRA模型，操作便捷、結果準確、全面客觀，所檢測的13種分涵蓋了處方中君、臣、佐藥的大部分主要活性成分，可用于GLX綜合質量評價，為該制劑質量控制提供參考。由于試驗所用樣品源于市場，樣品數量不夠大，其化學成分的差異性和關聯性還需要更多批次的樣品試驗數據去研究。