三物白散對胃癌細胞自噬相關蛋白Beclin1、LC3、p62表達的影響*

袁宇晴，龍 丹，謝超群，魏堰翀，劉旭東，朱 瑩，鄒君君

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

胃癌（gastric carcinoma，GC）是指原發于胃的上皮源性惡性腫瘤。胃癌是全球第五大惡性腫瘤，也是癌癥的主要致死原因之一[1]。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）統計，2020年我國胃癌新發病例超過47.9萬例，死亡病例達37.4萬例，分別占全球胃癌發病和死亡的44.0%和48.6%[2]。近年來，盡管在全球范圍內胃癌的總體發生率有所下降，但我國作為胃癌高發國家，在惡性腫瘤中其發病率和死亡率均高居第2位，防治意義重大[1]。目前，胃癌的發病機制尚未完全明確，可能與幽門螺桿菌感染、高鹽飲食、吸煙、飲酒等多種因素相關。胃癌的發生是綜合多個步驟和階段受多重因素相互影響作用的復雜過程，需要眾多基因的參與[3-4]。

早期GC可根據腫瘤侵犯深度，接受內鏡下治療或手術治療，但大多數病例在發現時已屬中晚期，失去了手術機會。目前放療、化療及靶向治療在GC治療方面的進展并不明顯，而中醫藥在治療GC上有著獨特的優勢。中藥在改善癌癥患者的生活質量和延長生存期方面發揮了不可或缺的作用，可通過抑制多藥耐藥性和減少副作用來提高療效[5-7]。“溫下法”治療胃癌的臨床療效顯著。前期研究表明：經方三物白散治療胃癌具有較好的臨床療效，但其作用機制仍不明確[8-10]。從“自噬”相關通路探討中醫藥治療胃癌的作用機制是當前研究的熱點[11-13]。自噬基因BECN 1（Beclin1）是哺乳動物參與自噬的特異性基因，可正向調節自噬。上調Beclin1表達可以誘導自噬的發生[14]。微管相關蛋白輕鏈3（LC3）是自噬性細胞死亡的特異性分子標志物。當自噬受到激活時，LC3通過被蛋白酶水解，轉化成微管相關蛋白輕鏈3Ⅰ（LC3-Ⅰ）的胞質蛋白。LC3-Ⅰ再與磷脂酰乙醇胺相互作用，轉變成微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）的膜蛋白。因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的高低可反映自噬的激活情況[15-16]。自噬降解底物蛋白1（p62）可以作為一種底物蛋白，將廣泛蛋白運送至自噬體內并在自噬過程中被消耗。自噬活性越強，p62表達越低[17-18]。本實驗基于三物白散對胃癌細胞自噬相關蛋白Beclin1、LC3、p62表達的影響，探究三物白散抗胃癌的作用機制，旨在為該方的臨床運用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物及細胞 28只SPF級雄性大鼠，8周齡，體質量（200.76±8.24）g，采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SYCK（湘）2020-0038。喂養環境室溫保持在20～25 ℃，濕度50%～70%，12 h/12 h明暗光照，動物自由進食進水，分籠飼養。本實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審批通過（審批號：ZYFY20220530-04）。胃癌細胞系AGS細胞（Procell CL-0022）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及試劑 三物白散混懸液由巴豆霜（含10%油）、浙貝母、桔梗（質量比為1：3：3）組成。飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經藥學部鄧桂明研究員鑒定為正品。兔源一抗p62（批號：00059474）、兔源一抗LC3B（批號00044252）、鼠源一抗Beclin1（批號00063125）、鼠源一抗β-actin（批號：00110322）均購自美國proteintech公司；miRNA逆轉錄試劑盒（批號：25722）、mRNA逆轉錄試劑盒（批號：09623）購自中國北京康為世紀有限公司。

1.3 主要儀器 磁力攪拌器（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：JB-13）；低速離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司，型號：SL02）；電磁爐（荷蘭飛利浦電子公司，型號：HD4925）；電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-2C）；電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，型號：JJ224BC）；化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；精密PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：PHS-3C）；生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）；水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCP-31DN）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀科學儀器設備有限公司，型號：H1650R）；旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）；搖床（其林貝爾儀器有限公司，型號：TS-1）；熒光PCR板（美國Thermofisher公司，型號：SPL0960）；熒光定量RCP儀（美國Thermofisher公司，型號：PIKOREAL96）；轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-40D）。

2 方法

2.1 藥物制備 根據本課題組前期研究方法[19-21]，將桔梗、浙貝打粉后，參照《傷寒論》原文，并參考《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算成大鼠給藥濃度，取含油量為10%的巴豆霜0.5 g、浙貝母1.5 g、桔梗1.5 g，混勻后加入超純水700 mL調節成0.005 g/mL的混懸液，封于玻璃瓶內，滅菌后4 ℃保存。

2.2 含藥血清制備 28只SPF級雄性大鼠，體質量200~220 g，編號后根據體質量用隨機數字法隨機分為空白組、三物白散低劑量組、三物白散中劑量組、三物白散高劑量組，每組7只，適應性飼養3 d。灌胃開始前，所有大鼠禁食12 h。三物白散低、中、高劑量組分別按0.031 25、0.062 5、0.125 0 g/（kg·d）劑量灌胃，空白組給予相同體積的生理鹽水，1 mL/（kg·d），1次/d，連續灌胃7 d。最后一次灌胃完成45 min后，將所有大鼠以0.3%戊巴比妥（10 mL/kg）麻醉。大鼠取仰臥位，“ V”型剪開大鼠腹部皮膚，用小濾紙片輕輕地將腸管及脂肪推向鼠左側腹部，使其腹主動脈充分暴露，采血針自下而上進針，待進針完成后，采血針另一側插入真空采血管中。采血結束后，將采血管室溫靜置1 h，以3 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心15 min，然后用移液器吸取上層血清到新的離心管中。離心管置于56 ℃水浴30 min滅活補體，用0.22 μm微孔濾膜無菌過濾后，分裝于2 mL離心管，儲存于-80 ℃冰箱，用于后續實驗。

2.3 細胞培養及分組 AGS細胞用10%的完全培養基（Ham's F 12營養液+10%胎牛血清FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液）置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。細胞分為空白對照組（空白組）、三物白散低劑量含藥血清組（低劑量組）、三物白散中劑量含藥血清組（中劑量組）、三物白散高劑量含藥血清組（高劑量組）。

2.4 CCK-8法檢測AGS細胞活性的影響 將生長狀況良好的細胞接種于6孔板中，經PBS沖洗、胰酶消化、離心后，添加完全培養基，吹打均勻成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，使得細胞數為2×103個/孔，在96孔板最外一周的孔中加入100 μL PBS防止揮發。待細胞密度長至50%~60%時高、中、低劑量組分別加入5%、10%、15%、20%的含藥血清，每組設置3個復孔，繼續培養24、48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液及試劑干預細胞，然后在細胞培養箱中孵育2 h。孵育完成后用酶標儀于450 nm波長處測定OD值。細胞活性=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

2.5 三物白散含藥血清對AGS細胞形態變化的影響 將活性、形態均正常的AGS細胞用胰酶消化，分別接種于6孔板中，并于37 ℃，5%CO2培養箱中培養12 h，待細胞貼壁后，分別加入空白血清、低劑量含藥血清、中劑量含藥血清、高劑量含藥血清，干預48 h，每組設3個復孔。分別于0、48 h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，比較細胞的形態變化。

2.6 LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA、Beclin1 mRNA表達 采用RT-qPCR法檢測LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA、Beclin1 mRNA表達。各組AGS細胞干預24、48 h后，使用Trizol、三氯甲烷、異丙醇提取細胞總RNA，紫光分光光度計測定RNA濃度和純度。配制反轉錄反應體系，將RNA反轉錄為cDNA，PCR進行定量擴增，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達 采用Western blotting法檢測LC3-Ⅱ、LC3-I、Beclin1、p62蛋白表達。各組AGS細胞干預24、48 h后，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。于蛋白樣品中按比例加入上樣緩沖液，100 ℃水浴中變性5 min，放入-80 ℃冰箱保存備用。SDS-PAGE電泳，轉膜，5%BSA室溫封閉1 h后加入一抗（1：1 000），4 ℃孵育過夜，二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，化學發光法顯影，用ImageJ軟件進行數據分析。實驗重復3次。

2.8 統計學方法 采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0統計分析軟件進行數據統計分析及繪圖。計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，計量資料符合正態分布且方差齊，采用One-Way ANOVA進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 三物白散含藥血清對AGS細胞活性的影響及最佳濃度的確定 當處理時間相同時，5%、10%、15%、20%高、中、低劑量組AGS細胞活性顯著低于空白組（P＜0.01）；10%、15%、20%高劑量組AGS細胞活性低于5%高劑量組（P＜0.05或P＜0.01），20%中劑量組AGS細胞活性低于5%中劑量組（P＜0.01），15%、20%低劑量組AGS細胞活性低于5%低劑量組（P＜0.05）；20%高劑量組AGS細胞活性低于10%、15%高劑量組（P＜0.01），20%中劑量組AGS細胞活性低于10%中劑量組（P＜0.05），20%低劑量組AGS細胞活性低于10%低劑量組（P＜0.05）。（見表2～4）

表2 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

表2 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與5%高劑量組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與10%高劑量組比較，dP＜0.01；與15%高劑量組比較，eP＜0.01。

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表3 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

表3 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與5%中劑量組比較，bP＜0.01；與10%中劑量組比較，cP＜0.05。

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表4 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

表4 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與5%低劑量組比較，cP＜0.05；與10%低劑量組比較，dP＜0.05。

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處理時間為48 h時，5%、10%、15%、20%高劑量組AGS細胞活性低于處理時間為24 h（P＜0.05或P＜0.01）；5%、15%中劑量組AGS細胞活性低于處理時間為24 h（P＜0.05或P＜0.01）；5%、10%、15%、20%低劑量組AGS細胞活性與處理時間為24 h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖1～3）

圖1 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，n=3）

圖2 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，n=3）

圖3 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對胃癌AGS 細胞活性的影響 （±s，n=3）

綜上所述，三物白散含藥血清對AGS細胞有明顯抑制作用，與空白組比較，5%、10%、15%、20%三物白散高劑量含藥血清可呈濃度-時間依賴性抑制AGS細胞活性，故選用抑制細胞活性效果最佳的20%濃度開展后續實驗。

3.2 三物白散含藥血清對AGS細胞形態的影響 空白組細胞間連接緊密，細胞形態呈較規則的多邊形，細胞數量較多。與空白組比較，低、中、高劑量組細胞間連接逐漸疏松，排列逐漸錯亂，細胞形態逐漸變細變長，形態欠規則，細胞數量逐漸減少。中、高劑量組部分細胞變成碎片，培養基表面漂浮少量死細胞。（見圖4）

圖4 三物白散含藥血清對AGS 細胞形態的影響 （×10）

3.3 三物白散含藥血清對AGS細胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA表達的影響 高、中劑量組AGS細胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相對表達量高于空白組，p62 mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.01）；低劑量組AGS細胞LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相對表達量高于空白組，p62 mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.01）。（見圖5）

圖5 三物白散含藥血清對AGS 細胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA 表達的影響（±s，n=3）注：與空白組比較，aP＜0.01。

3.4 三物白散含藥血清對AGS細胞Beclin1、p62蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響 高劑量組AGS細胞Beclin1蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于空白組，p62蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.01）；中劑量組AGS細胞Beclin1蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于空白組（P＜0.05或P＜0.01），p62蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.01）。（見圖6～7）

圖6 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、p62 蛋白表達Western blotting 圖

圖7 三物白散含藥血清對AGS 細胞Beclin1、p62 蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響 （±s，n=3）

4 討論

中醫學對腫瘤病理的認識基本達到共識，總結為“正”“邪”消長兩方面，即“正勝則邪卻”和“邪盛則病進”[22]。但治法上卻存在兩種觀點，即“扶正以祛邪”和“祛邪以扶正”。基于中醫理論“邪之所湊，其氣必虛”，“壯實人無積，虛人則有之”，中晚期腫瘤的治療主要應用“扶正以祛邪”治則，選方用藥偏重補益[23-24]。此外，“祛邪以扶正”亦在中醫古籍中早有記載，如“堅者削之”“結者散之”等[25]。“癥瘕”“反胃”“積聚”等疾病包含了現代醫學范疇的中晚期腫瘤。張從正從“扶正”的角度來探討“祛邪”治則，提出“先論其攻邪，邪去而元氣自復也”，“醫之道，損有余，乃所以補其不足也”，即為“不補之中有真補存焉”。下法能夠使“陳痤去而腸胃潔，癥瘕盡而榮衛昌”，突出了“祛邪以扶正”的治療原則[26]。

三物白散首載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，即“寒實結胸，無熱證者，與三物小白散”[27]。三物白散作為溫下逐邪治法的經典名方，由巴豆、貝母、桔梗組成。巴豆味辛、性熱，歸胃經、大腸經，有利水谷道之效，可破通五臟六腑久積之閉塞[28]；桔梗味苦、辛，性平，歸肺經、胃經，宣暢氣機，寬利胸膈，可破滯氣及積塊[29]；貝母味苦，性寒，歸肺經、心經，清熱化痰，散結解毒，散心胸久郁痰結[30]。全方藥簡力專，能溫下寒實又不誤祛痰結邪氣。三物白散以攻伐為重點，但內含桔梗作為“舟車之輯”，又有巴豆可以逐水，實則蘊含了“其高者，因而越之；其下者，引而竭之”這一“因勢利導”的治療法則。這可理解為給邪以出路。現代藥理研究表明，桔梗具有調節免疫功能的作用[31]。這可理解為方中所寓之“補”。

GC是指來源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。現代醫學通常采取外科手術治療、化學治療或姑息療法[32]，但由于早期胃癌發現難度較高，且術后胃癌細胞擴散轉移率高，外科手術治療存在較大風險及局限性。近年來，研究自噬對胃癌細胞的干預機制成為GC診療的新方向。自噬能夠有效抑制GC細胞的增殖、提高人體對化療靶向藥物的反應敏感性[33-34]。自噬全程從啟動直到其終止由數種蛋白質分子共同調控。到目前為止，在酵母中發現的與自噬特異性調控有關的蛋白質基因有四十余種，被稱為自噬相關蛋白（ATG）。絕大多數ATG在哺乳動物的基因組之間同源性顯著。

Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。Beclin1是自噬的正向調節基因，上調Beclin1的表達可以誘導自噬的發生。Beclin1既可以與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）相互結合，形成Beclin1-PI3KC3-Vps15復合體，促進自噬發生，又可以與抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相互結合，形成Beclin1-Bcl-2復合體，抑制自噬活性。在特定情況下，c-Jun氨基末端激酶1能夠將Bcl-2基因磷酸化，繼而與Beclin1基因分離，從而誘導自噬。微管相關蛋白1輕鏈3（MAPLC3）是酵母ATG8的同系物，可分為2種類型，分別為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ主要存在于細胞質中，而LC3-Ⅱ主要存在于自噬體及自噬溶酶體膜上[35]。當自噬受到激活時，LC3被蛋白酶水解，轉化成LC3-Ⅰ的胞質蛋白。LC3-Ⅰ再與磷脂酰乙醇胺相互作用，轉變成LC3-Ⅱ的膜蛋白。因此，LC3是自噬性細胞死亡的特異性分子標志物。LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的高低可檢測自噬的發生[36]。p62在人體中又稱SQSTM1，可與極化調節蛋白非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，a PKC）形成配體關系，是一種結構域相當豐富的蛋白，參與了眾多信號路徑的反應[37]。p62可以作為一種底物蛋白，將廣泛蛋白運送至自噬體內并在自噬過程中被消耗，與自噬具有雙向性的調控作用。它可以激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1（mammalian target of rapamycin 1，mTORC1）下調自噬活性，而自噬抑制反過來會導致它的聚集，進一步加強自噬被抑制，最終導致p62的大量聚集[17]。

研究表明，加味三物白散方聯合化療能明顯提高胃癌患者的臨床受益率、遠期生存率、生活質量及對化療的耐受性[38]。三物白散含藥血清不僅能有效抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，還能通過Survivin基因沉默轉染，對胃癌SGC-7901細胞起到誘導凋亡、抑制遷移的作用[39-40]。此外，徐力等[41]發現，三物白散加味方可以下調胃癌相關基因P53、Bcl-2、rasP21、CD44的表達，這可能是其抗胃癌的作用機制之一；王明艷等[42]發現，三物白散加味方可能通過阻滯胃癌SGC-7901細胞G2/M周期，進而誘導細胞凋亡；王梅等[43]發現，三物白散可逆轉Th1/Th2的漂移，從而發揮抗腫瘤的免疫正向調節作用；王莉蘭等[44]發現，三物白散可調控TGF-β/Smad通路抑制TGF-β1，誘導胃癌SGC-7901細胞上皮-間質轉化的發生。

本實驗結果顯示，在相同作用時間下，AGS細胞活性隨著三物白散含藥血清濃度的升高而降低。在三物白散含藥血清濃度為20%時，AGS細胞活性最低。在相同處理濃度下，細胞活性隨著處理時間的延長而降低，在48 h時細胞活性最低。說明三物白散高劑量含藥血清可呈濃度-時間依賴性抑制AGS細胞活性。同時，隨著三物白散含藥血清濃度升高，細胞形態逐漸不規則，細胞數量逐漸減少。此外，三物白散可上調Beclin1、LC3表達，下調p62的表達，誘導GC細胞自噬。

綜上所述，三物白散高劑量含藥血清能抑制胃癌AGS細胞增殖，該效應呈濃度-時間依賴性。三物白散可上調Beclin1、LC3表達，下調p62表達，誘導胃癌細胞自噬。這可能是其抗胃癌作用機制之一。