麝香酮調節cGAS-STING信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經炎癥的影響*

剛 瑛，丁 鵬，李 冰，張文想

（北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是由血栓形成或栓塞引起的腦血流中斷，是世界死亡和殘疾的主要原因之一，嚴重影響人類健康[1]。IS的病理生理機制包括離子失衡、氧化應激、神經炎癥和免疫細胞異常激活，可導致神經元壞死和凋亡。其中炎癥反應是腦缺血組織損傷的基礎，大腦中發生炎癥后，小膠質細胞或其他免疫細胞活化導致促炎性細胞因子釋放，促進白細胞浸潤并進入腦組織，導致免疫系統激活，參與IS進展并對疾病產生嚴重影響[2]。因此，抑制炎癥反應對于改善IS預后至關重要。麝香酮是中藥麝香的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、神經保護等作用。已有研究發現，麝香酮不僅具有促進IS后神經功能恢復的作用，還能減輕脊髓型頸椎病大鼠神經炎癥和神經元損傷[3-4]。環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）作為胞質DNA傳感器，在識別單鏈和雙鏈DNA后合成第二信使2'3'-cGAMP，結合并激活干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）介導炎癥反應和免疫失衡。cGAS可作為各種神經系統疾病的治療靶點[5]。已有研究發現cGAS-STING通路的激活參與IS后神經炎癥，因此抑制cGAS-STING通路可能有效緩解神經炎癥相關損傷及相關神經病理學[6]。在IS大鼠體內麝香酮能否通過調節cGAS-STING信號通路改善神經損傷和炎癥尚不清楚，因此本研究通過構建IS大鼠模型，對其進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級SD雄性大鼠60只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2019-0008，實驗動物合格證號：SYXK（京）2020-0013。8周齡左右，體質量（250±20）g，適應性喂養1周，飼養環境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h光暗循環，不禁水食。本研究通過我院動物倫理委員會批準（批號：2021-00915）。

1.2 藥品與試劑 麝香酮（純度≥98%，批號：541-91-3）購自上海麥克林生化科技有限公司；cGAS抑制劑RU.521（批號：HY-114180）、STING激動劑2′3′-cGAMP（批號：HY-100564）購自美國MedChemExpress公司；白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：EK-R36877）購自上海酶研生物科技公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：ml002953）、IL-6 ELISA試劑盒（批號：ml064292）購自上海酶聯生物公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號：60524ES60）購自上海翌圣生物公司；TTC染色液（批號：SBJ-0485）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Nissl染色液（批號：R20625）購自上海源葉生物公司；TUNEL試劑盒（批號：E-CK-A320）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限；一抗p-IRF3（批號：ab76493）、IRF3（批號：ab238521）、二抗辣根酶標記山羊抗兔（批號：ab205719）購自美國Abcam公司；一抗IL-1β（批號：AB2915846）、TNF-α（批號：AB2204371）、cGAS（批號：AB2915749）、STING（批號：AB11153185）和β-actin抗體（批號：AB2792414）購自美國賽默飛世爾公司；RIPA裂解液（批號：SY4680）購自北京伊塔生物科技有限公司；ECL發光試劑盒（批號：abs920）購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 SpectraMax i3x多功能動酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）；CX41-12C02光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Phenom電子顯微鏡（上海復納科學儀器有限公司）；HT165R離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；HY2508石蠟切片機（金華惠友儀器設備有限公司）。

1.4 IS大鼠模型構建 隨機選取50只大鼠，采用大腦中動脈閉塞（MCAO）法構建IS大鼠模型[7]，麻醉大鼠并保持每只大鼠直腸溫度在（36.5±0.5）℃，暴露大鼠右側頸總動脈結構至分叉處，用6.0 mm絲線結扎頸外動脈遠心端，另一絲線穿過頸外動脈并在頸總動脈分叉處附近打結，使用動脈夾夾閉頸總動脈，將尼龍線插入頸外動脈、頸內動脈并繼續進入大腦中動脈，缺血1 h后，去除線栓，縫合頸部傷口。對照組大鼠10只暴露頸總動脈結構至分叉處，后縫合傷口，不進行其他操作。對各組大鼠進行Longa神經功能評分，評分＞1分表明MCAO模型構建成功。

1.5 大鼠分組和藥物干預 將SD大鼠分為對照組、MCAO組、MCAO+RU.521組、麝香酮組、麝香酮+2′3′-cGAMP組，除去死亡和建模失敗的大鼠，每組10只。MCAO后24 h，MCAO+RU.521組大鼠鼻內給藥RU.521（450 μg/kg）溶解于1%二甲基亞石風（DMSO）+玉米油[8]，麝香酮組大鼠鼻內給藥麝香酮（5 mg/kg）溶解于1% DMSO[3]，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠鼻內給藥麝香酮（5 mg/kg）和2′3′-cGAMP（500 μg/kg）溶解于1%DMSO中[8]，對照組和MCAO組大鼠給予相同劑量生理鹽水。1次/d，連續給藥7 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經功能缺損評分 給藥結束后，對大鼠進行神經功能評分：0分，無神經功能缺損；1分，對側前肢無法伸展；2分，對側前肢嚴重屈曲；3分，走路時向對側傾斜；4分，沒有自主活動，意識障礙。評分范圍1～4分，分值越高表明神經缺損越嚴重。

1.6.2 TTC染色檢測腦梗死面積 神經功能缺損評分后麻醉處死大鼠，取5只大鼠腦組織-20 ℃下冷凍，將腦冠狀面切片（約2 mm）在2% TTC溶液中染色30 min，翻轉數次，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定2 h，拍照并計算相對腦梗死面積=梗死面積/總面積×100%。

1.6.3 HE染色和Nissl染色觀察 取剩余5只大鼠海馬組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片（5 μm）后用HE染色、Nissl染色，在光學顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理變化和神經元損傷。

1.6.4 TUNEL法檢測神經元凋亡 取大鼠海馬組織石蠟切片，按照TUNEL試劑盒說明書染色，4 ℃孵育過夜，洗滌后與熒光二抗在37 ℃下孵育1 h，并用DAPI進行核染，在顯微鏡下觀察拍照。

1.6.5 ELISA法檢測炎癥因子水平 取大鼠海馬組織，剪切、研磨，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測炎證因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.6.6 Western blotting法檢測蛋白表達 取大鼠海馬組織，用RIPA裂解，提取總蛋白，定量后按步驟進行SDS-PAGE電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3、IRF3（1：1 000）和內參β-actin過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1：2 000），孵育2 h。用ECL發光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

1.7 統計學方法 應用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，數據采用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 與對照組比較，MCAO組大鼠神經功能缺損評分升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠神經功能缺損評分降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠神經功能缺損評分與麝香酮組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠神經功能缺損評分升高（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 （±s，n=10）

2.2 各組大鼠TTC染色腦梗死面積比較 與對照組比較，MCAO組大鼠腦梗死面積顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠腦梗死面積顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠腦梗死面積與麝香酮組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠腦梗死面積顯著升高（P＜0.05）。（見圖2～3）

圖2 大鼠TTC 染色腦梗死面積比較 （±s，n=5）

圖3 各組大鼠腦組織TTC 染色結果

2.3 各組大鼠HE染色和Nissl染色結果比較 HE染色顯示，對照組大鼠海馬組織神經元形態結構正常，細胞排列緊密，細胞核仁清晰且胞質豐富；MCAO組大鼠海馬組織神經元細胞皺縮，細胞排列松散且腫脹；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經元病理損傷減輕，形態有所恢復，細胞變異程度減輕；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經元病理損傷加重。Nissl染色顯示，對照組大鼠海馬神經細胞形態結構正常，Nissl體豐富；MCAO組大鼠海馬神經元細胞萎縮，核質固縮，Nissl體顯著減少；MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經元細胞形態有所恢復，Nissl體增加；麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經元細胞損傷程度較麝香酮組加重。（見圖4）

圖4 大鼠海馬組織HE 染色和Nissl 染色結果 （×400）

2.4 各組大鼠神經元細胞凋亡情況比較 與對照組比較，MCAO組海馬組織神經元凋亡數目增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組神經元凋亡數目減少，凋亡率顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組神經元凋亡數目和凋亡率與麝香酮組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組神經元凋亡數目增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 大鼠海馬組織TUNEL 染色結果 （×400）

圖6 各組大鼠神經元凋亡率比較 （±s，n=10）

2.5 各組大鼠炎癥因子水平比較 與對照組比較，MCAO組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平與麝香酮組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。（見圖7）

圖7 各組大鼠炎癥因子水平比較 （±s，n=10）

2.6 各組大鼠海馬組織蛋白表達比較 與對照組比較，MCAO組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠各蛋白相對表達量與麝香酮組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）。（見圖8～9）

圖8 大鼠海馬組織蛋白表達Western blotting 圖

圖9 各組大鼠海馬組織蛋白相對表達量比較 （±s，n=5）

3 討論

IS是一種常見的腦血管疾病，主要是由大腦血管突然阻塞，從而限制相關區域的血液流動或供應引起的，其中中風會增加認知缺陷、長期殘疾、抑郁和癡呆的風險，嚴重影響人類健康狀況和生活質量[9]。目前IS的主要臨床治療措施是溶栓、血栓切除術、抗血小板聚集和神經營養等，以盡快恢復缺血區的腦血流和神經功能，但這些療法的使用受時間窗口和出血風險的限制。神經炎癥是IS的主要病理過程。IS導致神經元細胞死亡，使小膠質細胞和星形膠質細胞過度活化，釋放出高水平的炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α，并促進白細胞進入腦組織，產生炎癥級聯反應，促進更多神經元死亡并加重腦損傷[10]。HAN B等[11]發現小膠質細胞PGC-1α通過抑制神經炎癥來防止IS后腦損傷；ZHANG Y等[12]也發現SerpinA3N通過減少細胞凋亡和神經炎癥可減輕IS后腦損傷。因此，在IS后抑制炎癥反應可緩解腦損傷。

本研究通過使用MCAO法構建IS大鼠模型發現，MCAO組大鼠神經功能缺損評分和腦梗死面積顯著升高，海馬組織神經元細胞皺縮損傷，Nissl體減少，且神經元凋亡數目增加，表明MCAO組大鼠出現嚴重神經功能損傷。且海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高，表明MCAO組大鼠出現神經炎癥。麝香酮在腦血管疾病中具有神經保護作用，包括抗氧化應激、抗缺血性損傷、抗凋亡、抗炎和觸發神經保護等。其中麝香酮通過作為神經保護和促血管生成劑起到對急性腦缺血再灌注損傷的保護作用[13]；麝香酮還能通過減少神經元壞死，保護血腦屏障，改善腦缺血引起的神經損傷[14]。本研究通過選用麝香酮鼻內給藥的方式對MCAO組大鼠進行治療。鼻內給藥使麝香酮能直接通過鼻黏膜或肺部的毛細血管吸收，通過鼻黏膜-腦脊液途徑直接進入腦脊液，繞過血腦屏障直接遞送到腦。麝香酮鼻腔給藥具有生物利用度高、見效快、安全、有效等特點[15]。本研究發現，MCAO組大鼠經麝香酮治療后，神經功能缺損評分和腦梗死面積降低，海馬組織神經元損傷得到改善，Nissl體增加，且神經元凋亡數目和IL-6、IL-1β、TNF-α含量減少，表明麝香酮對MCAO組大鼠神經元功能障礙和神經炎癥具有改善作用。

胞質dsDNA已被證明可激活炎癥和免疫反應。cGAS是一種關鍵的胞質DNA傳感器，可通過合成cGAMP激活STING，觸發由STING級聯介導的下游促炎信號，同時炎癥因子可激活IRF3、NF-κB等途徑，因此cGAS-STING通路的激活被認為與神經病理生理學密切相關[16]。已有研究發現cGAS-STING參與創傷性腦損傷[17]、肌萎縮側索硬化癥[18]、阿爾茨海默病[19]等多種動物模型中的神經炎癥。cGAS-STING也與IS后的腦損傷和神經炎癥密切相關。抑制cGAS或cGAS缺失均會減弱IS后的神經炎癥，改善腦損傷[20-21]。本研究發現，MCAO組大鼠海馬組織cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達顯著升高，表明IS可能激活cGAS-STING信號通路，參與其腦損傷和神經炎癥；而麝香酮治療后cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達降低，麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路的激活，改善MCAO組大鼠腦損傷和神經炎癥。為進一步驗證麝香酮對cGAS-STING信號通路的干預作用，本研究在MCAO的基礎上加上cGAS抑制劑RU.521，其作用與麝香酮對神經損傷的改善作用一致，表明麝香酮可能發揮cGAS抑制劑的作用；此外，本研究在麝香酮基礎上加上STING激動劑2′3′-cGAMP，麝香酮對神經損傷的改善作用受到抑制，因此麝香酮可能抑制cGAS-STING信號通路激活發揮作用。

綜上所述，麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路激活，減少神經元損傷，改善IS大鼠神經炎癥。本研究為改善IS大鼠神經損傷和神經炎癥提供了新思路，但麝香酮對IS大鼠的其他分子機制仍有待闡明。