人參皂苷對過氧化氫誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

劉曉鳳,盧曉琴,鐘浩,HUSSAIN Muhammad,王麗娜,楊夢雨,張嘉寧,關(guān)榮發(fā)

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)

人參皂苷又稱三萜皂苷,是從人參屬藥材中提取的一類固醇類化合物。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷具有多種藥理學(xué)特性,包括免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤和抗炎[2]等,對中樞神經(jīng)、心腦血管和免疫系統(tǒng)均有顯著的保護(hù)作用,可廣泛用于相關(guān)疾病的治療[3]。人參皂苷作為一種天然抗氧化劑,可以清除自由基,在抗氧化方面具有巨大潛力。

氧化應(yīng)激是指抗氧化防御機(jī)制受到破壞,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),細(xì)胞內(nèi)會大量產(chǎn)生和積累活性氧(reactive oxygen species,ROS)。ROS的生成會通過體外的異常刺激而增加,過量積累的ROS會直接破壞細(xì)胞內(nèi)的生物分子,比如蛋白質(zhì)氧化、破壞DNA[4-5]等,使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損。H2O2是ROS的主要來源,通過產(chǎn)生羥自由基(·OH)直接損傷細(xì)胞內(nèi)生物分子。引起腸道屏障功能喪失的主要原因之一就是氧化應(yīng)激能夠造成腸細(xì)胞上皮損傷。小腸上皮細(xì)胞是人體腸道重要的物理性防御結(jié)構(gòu),這種腸道屏障可以有效阻礙毒素、細(xì)菌和其他有害物質(zhì)侵入血液系統(tǒng)[6],進(jìn)而避免侵犯其他器官。人結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞與人類正常小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能類似,具有與正常細(xì)胞類似的微絨毛和相關(guān)酶系,Caco-2細(xì)胞可用于腸上皮損傷和修復(fù)的體外研究[7-9]。因此本研究以H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型,評估人參皂苷的抗氧化保護(hù)作用,為后續(xù)研究人參皂苷抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株,上海啟達(dá)科技有限公司,本實(shí)驗室保存。

1.1.2 藥品與試劑

人參皂苷(純度≥99.5%),中國計量大學(xué),實(shí)驗室提取;30% H2O2,上海泰坦科技股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶,上海啟達(dá)科技有限公司;CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測試試劑盒(P0012)、細(xì)胞毒性檢測試劑盒(C0016),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(A005-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(A001-3)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(A003-1)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TS100倒置顯微鏡,日本尼康公司;SpectraMax iD3/iD5多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;HERAcell 240細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

Caco-2細(xì)胞用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1～2 d換1次培養(yǎng)液。待長至80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分別接種于6孔(1×105個/孔)和96孔(1×104個/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),對照組為未經(jīng)任何處理的正常Caco-2細(xì)胞;損傷模型組以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含有200 μmol/L H2O2)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,制備H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型。氧化損傷模型細(xì)胞以不同濃度的人參皂苷繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

Caco-2細(xì)胞經(jīng)過孵育后,向每孔中加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。根據(jù)CCK-8試劑盒提供公式(1)計算細(xì)胞存活率。

(1)

式中:A,吸光值。

1.2.3 氧化應(yīng)激模型的建立及毒性檢測

細(xì)胞經(jīng)過傳代之后,待其長至80%左右,消化細(xì)胞,將Caco-2細(xì)胞分為對照組和氧化損傷模型組,每孔設(shè)置3個平行孔。將細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL,對照組加入相同體積細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁后,對照組和模型組分別加入10 μL細(xì)胞培養(yǎng)基,再向模型組加入不同濃度的H2O2,繼續(xù)孵育2、4、6、8 h。最后加入CCK-8試劑并繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.4 胞內(nèi)ROS含量檢測

細(xì)胞以4×104個/孔的密度接種至96孔板中,按照1.2.1節(jié)中的分組及實(shí)驗要求干預(yù)細(xì)胞后,吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS沖洗2遍,再用無血清培養(yǎng)基稀釋樣品,加入新鮮培養(yǎng)基置于恒溫箱中孵育30 min后,取出用PBS沖洗2遍,15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測胞內(nèi)ROS含量,并與模型組對比。

1.2.5 氧化損傷模型中胞內(nèi)指標(biāo)的檢測

收集細(xì)胞并以5×105個/孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行孵育,將細(xì)胞分為對照組、H2O2組(200 μmol/L+4 h)和保護(hù)組(人參皂苷預(yù)處理+200 μmol/L+4 h),收集細(xì)胞,使用BCA蛋白濃度試劑盒測定每組細(xì)胞蛋白濃度,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)GSH-Px和MDA的測定。

采用WST-1法測定細(xì)胞中SOD活性,根據(jù)前段分組方法,孵育之后,去除培養(yǎng)基,加入細(xì)胞裂解液,每孔100 μL,低溫下裂解10 min,裂解液4 ℃、離心(100×g,10 min)后,收集上清液采用BCA蛋白濃度試劑盒測定每組細(xì)胞蛋白濃度,再根據(jù)試劑盒說明書測定胞內(nèi)SOD水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗重復(fù)3次,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,實(shí)驗數(shù)據(jù)使用SPSS和Excel處理,由Origin繪圖,通過單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)一步分析差異顯著性,組間比較采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析,P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著、極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對Caco-2細(xì)胞存活率的影響

H2O2作為ROS主要成分之一,能夠通過細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),性質(zhì)比較穩(wěn)定,當(dāng)與胞內(nèi)Fe3+反應(yīng)時會形成具有極強(qiáng)毒性的·OH,具有強(qiáng)氧化性,能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,可作為細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型的誘導(dǎo)劑[10-11]。構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型要求在適宜環(huán)境下,使細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激損傷,誘導(dǎo)時控制細(xì)胞存活率在50%左右為最佳[12],因為細(xì)胞存活率過高導(dǎo)致誘導(dǎo)不明顯,不具目的性;過低會發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷,即使添加抗氧化物質(zhì),也不能使細(xì)胞氧化損傷恢復(fù)。H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立如圖1所示。

圖1 不同濃度H2O2對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentration of H2O2 on survival rate of Caco-2 cells

采用100、200、300、400 μmol/L H2O2分別作用Caco-2細(xì)胞2、4、6、8 h,細(xì)胞活力均隨時間的延長而逐漸下降,當(dāng)H2O2濃度200 μmol/L,作用Caco-2細(xì)胞4 h時,細(xì)胞存活率為(53±2)%(P<0.05),具有統(tǒng)計學(xué)意義,因此采用該濃度和作用時間作為誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的最佳條件。

2.2 人參皂苷預(yù)處理后每組Caco-2細(xì)胞的存活率

實(shí)驗設(shè)置10、20、40、100、200、500 μg/mL的人參皂苷進(jìn)行毒性試驗,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞的存活率為100%進(jìn)行對照,對不同濃度人參皂苷的安全計量進(jìn)行分析,篩選人參皂苷最適濃度進(jìn)行后續(xù)試驗,結(jié)果如圖2所示,人參皂苷的質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL時,每組對應(yīng)的細(xì)胞存活率在95%～100%,即在此濃度范圍內(nèi)人參皂苷不具毒性。本實(shí)驗選擇0～50 μg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 不同濃度的人參皂苷對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ginsenosides on survival rate of Caco-2 cells

2.3 Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

由圖3可知,未經(jīng)任何處理的Caco-2細(xì)胞緊密貼壁生長,細(xì)胞膜完整光滑;經(jīng)H2O2處理后的細(xì)胞明顯受到破壞,部分細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞間孔隙增加,細(xì)胞數(shù)量急劇減少;而加入人參皂苷處理后可明顯改善這些情況,添加10～500 μg/mL的人參皂苷可以明顯改善H2O2引起的細(xì)胞損傷,使細(xì)胞恢復(fù)光滑完整的形態(tài)。

a-正常Caco-2細(xì)胞;b-H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞;c-10 μg/mL人參皂苷預(yù)處理;d-100 μg/mL人參皂苷預(yù)處理;e-500 μg/mL人參皂苷預(yù)處理圖3 細(xì)胞形態(tài)觀察(×20)Fig.3 Observation of cell morphology(×20)

2.4 人參皂苷對H2O2氧化損傷Caco-2細(xì)胞活性的影響

以200 μmol/L H2O2作用4 h建立Caco-2細(xì)胞損傷模型,采用不同質(zhì)量濃度(10、20、50 μg/mL)的人參皂苷干預(yù)H2O2誘導(dǎo)后的Caco-2細(xì)胞。如圖4所示,與模型組相比干預(yù)組細(xì)胞存活率明顯升高,分別達(dá)到(82.58±1.2)%、(86.5±0.8)%、(91.04±1.5)%,由此說明人參皂苷預(yù)處理可以使H2O2誘導(dǎo)的Caco-2氧化應(yīng)激損傷得到緩解,同時也說明在選定濃度范圍下呈劑量依賴關(guān)系,人參皂苷對H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用。

圖4 人參皂苷對氧化損傷細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effect of ginsenosides on the activity of cells damaged by oxidation注:*表示與H2O2誘導(dǎo)損傷組相比差異性顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01);#表示與對照組相比顯著性差異顯著(P<0.05),##極顯著(P<0.01)(下同)。

2.5 人參皂苷對氧化應(yīng)激模型中ROS產(chǎn)生的影響

氧化應(yīng)激的形成是由于ROS的過量產(chǎn)生導(dǎo)致氧化失衡的結(jié)果,當(dāng)自由基與抗氧化劑的水平失衡時,自由基會與人體細(xì)胞發(fā)生化學(xué)結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞損傷而引起許多疾病[13-14]。因此,加強(qiáng)機(jī)體氧化系統(tǒng)的防御是拮抗氧化應(yīng)激的重要手段。酶標(biāo)儀檢測Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量結(jié)果顯示,加入H2O2的Caco-2細(xì)胞內(nèi)的ROS含量明顯增加(P<0.01),當(dāng)采用不同濃度的人參皂苷進(jìn)行干預(yù)后,可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,如圖5所示,隨著人參皂苷濃度的增加,胞內(nèi)ROS含量下降,表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。因此人參皂苷可以抑制由于H2O2誘導(dǎo)所致的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量。

圖5 人參皂苷對H2O2誘導(dǎo)損傷Caco-2細(xì)胞的ROS含量的影響Fig.5 Effects of ginsenosides on ROS content in Caco-2 cells damaged by H2O2

2.6 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細(xì)胞中氧化酶的影響

SOD和GSH-Px是細(xì)胞中重要的抗氧化酶類,能有效清除自由基,具有解毒作用,同時也是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用的主要成分,可以防御外源物質(zhì)的刺激,阻止胞內(nèi)脂質(zhì)氧化,進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力[15-16]。

如圖6所示,與對照組相比,模型組中Caco-2細(xì)胞受到H2O2的刺激后,胞內(nèi)SOD和GSH-Px的含量明顯降低(P<0.01),與模型組相比,經(jīng)過人參皂苷處理后,Caco-2細(xì)胞SOD的含量明顯升高;與模型組相比,當(dāng)添加10 μg/mL人參皂苷時,細(xì)胞內(nèi)SOD的含量顯著增加(P<0.05),當(dāng)人參皂苷質(zhì)量濃度≥20 μg/mL時,胞內(nèi)SOD的含量極顯著增加(P<0.01);此外,經(jīng)人參皂苷處理后,顯著提高了Caco-2細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的水平,且呈一定劑量依賴關(guān)系。

a-SOD;b-GSH-Px圖6 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細(xì)胞中SOD和GSH-Px水平的影響Fig.6 Effects of ginsenosides on the levels of SOD and GSH-Px activity in Caco-2 cells damaged by H2O2

2.7 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細(xì)胞中MDA的影響

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后,氧化應(yīng)激的程度被加深,打破原本平衡的狀態(tài),會引起細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng),而MDA正是脂質(zhì)過氧化作用后的最終產(chǎn)物之一,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化程度可以用MDA水平來表示,其含量可以間接反映出氧化損傷的程度[17]。如圖7所示,與對照組相比,模型組的MDA極顯著提高(P<0.01);與損傷組相比,人參皂苷組(10～50 μg/mL)顯著降低MDA含量,從而抑制Caco-2受到H2O2的破壞,人參皂苷對氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

圖7 人參皂苷對H2O2誘導(dǎo)損傷Caco-2細(xì)胞的MDA含量的影響Fig.7 Effect of ginsenosides on MDA content in Caco-2 cells damaged by H2O2

3 結(jié)論

復(fù)雜的腸道環(huán)境使腸上皮細(xì)胞極易受到自由基的損傷,從而引發(fā)腸道炎癥,腸道細(xì)胞氧化應(yīng)激模型在抗氧化活性的研究中發(fā)揮重要作用。研究表明人參皂苷具有多種生理功能,本研究以H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,選擇SOD、GSH-Px和MDA作為評價腸細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo),研究人參皂苷對細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。試驗設(shè)計了對照組、模型組和實(shí)驗組,通過不同質(zhì)量濃度(10～50 μg/mL)人參皂苷對產(chǎn)生氧化應(yīng)激的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),結(jié)果證實(shí)了人參皂苷具有一定的清除自由基的能力,能夠延緩氧化作用所造成的細(xì)胞死亡、提高細(xì)胞活力以及細(xì)胞自身的氧化損傷作用。在氧化損傷應(yīng)激模型中,通過降低胞內(nèi)ROS的生成,提高細(xì)胞內(nèi)源性酶SOD和GSH-Px活性,降低胞內(nèi)MDA含量來保護(hù)Caco-2細(xì)胞。人參皂苷能夠預(yù)防和改善由氧化應(yīng)激損傷帶來的損傷。當(dāng)機(jī)體抗氧化酶受到誘導(dǎo)表達(dá)增高時,被認(rèn)為是組織細(xì)胞對氧化應(yīng)激因素的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)。研究表明氧化應(yīng)激會引起機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡,從而使細(xì)胞內(nèi)ROS等物質(zhì)大量積累,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。隨著抗氧化深受重視,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激損傷與老年性、慢性疾病密切相關(guān),且其會引起一系列并發(fā)癥。越來越多的天然活性物質(zhì)抗氧化生理功效的相關(guān)研究表明,單一物質(zhì)的抗氧化效果可能無法達(dá)到精準(zhǔn)快速的抗氧化作用,多種天然活性物質(zhì)的聯(lián)合可以實(shí)現(xiàn)增效的效果,未來對聯(lián)合使用多種物質(zhì)治療氧化應(yīng)激引起的損傷是一種趨勢,本研究可以為氧化應(yīng)激引起損傷的治療提供科學(xué)依據(jù)。