靈芝孢子油緩解小鼠體力疲勞的作用及其機制研究

于夢淇,黃淑貞,劉雨菲,楊華,曹莉,張立實,陳錦瑤*

1(四川大學 華西公共衛生學院/華西第四醫院,四川 成都,610041)2(四川省食品安全監測與風險評估重點實驗室,四川 成都,610041)

疲勞是指由于睡眠不足、長時間腦力或體力活動、或是長時間的壓力或焦慮而導致的一種疲憊困倦的狀態[1]。研究顯示,30%～50%的受訪群眾有疲勞癥狀[2]。疲勞可分為心理疲勞和體力疲勞,其中體力疲勞又稱運動疲勞,表現為運動耐力下降以及無法維持長時間或劇烈活動[3]。長期疲勞會導致一系列繼發問題,如身體功能障礙、能量失衡、焦慮、抑郁、認知障礙、睡眠質量差等,甚至會加速慢性腎病等疾病的發生,嚴重影響身體健康[4-6]。因此,研發具有緩解體力疲勞的功能食品具有積極的健康促進意義。

靈芝(Ganodermalucidum)是我國傳統的藥食兩用真菌,含有多酚類、多糖類、類固醇類、三萜類化合物等天然生物活性成分,具有抗炎、抗菌、保肝、免疫調節等作用[7]。靈芝孢子是靈芝子實體的生殖細胞,其藥用價值明顯高于靈芝子實體[8]。靈芝孢子油(Ganodermalucidumspore oil,GLSO)是通過超臨界二氧化碳萃取技術從破壁靈芝孢子中提取得到的脂溶性活性物質[9-10]。研究表明,靈芝孢子油具有良好的抗氧化作用[11]及增強免疫功能[12-16]。目前關于靈芝在緩解體力疲勞上的相關研究主要集中在靈芝子實體、靈芝菌絲體和靈芝復方制劑上,對于靈芝孢子油的研究較少且其緩解體力疲勞的機制尚不明確。

因此,本研究參考《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中緩解體力疲勞的檢驗方法,采用不同劑量的靈芝孢子油對小鼠進行灌胃,結合負重游泳時間、血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肝糖原、肌糖原、血乳酸(blood lactic acid, BLD)以及腓腸肌糖原及肌細胞調亡等指標的測定,探討靈芝孢子油緩解體力疲勞的作用及其體制,以期為靈芝孢子油抗疲勞保健食品的開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 受試物

靈芝孢子油,廣州某公司,人體推薦攝入量為2.4 g/d。

1.2 實驗動物

健康SPF級雄性KM小鼠144只,體重18～22 g[北京華阜康生物科技股份有限公司,動物合格證號SCXK(京)2019-0008],飼養于四川大學華西公共衛生學院屏障級動物房,飼料與墊料均由動物房提供。飼養條件:溫度20～26 ℃,濕度40%～70%,明暗交替周期為12 h。本研究經四川大學華西第四醫院/華西公共衛生學院倫理委員會批準(批件號:Gwll2023001)。

小鼠按體重隨機分為4組,即溶劑對照組、靈芝孢子油低、中、高劑量組,每組36只動物,共分為4批。第I批的8只小鼠用于負重游泳實驗,第II批的8只小鼠用于測定肝糖原,第III批的8只小鼠用于BUN測定、肌糖原測定以及后續機制指標的測定,第IV批的12只小鼠用于BLD測定。

1.3 劑量選擇及受試物給予方式

靈芝孢子油的人體推薦劑量為2.4 g/d,成人體重以60 kg計,則每日推薦劑量為0.04 g/kg·bw。靈芝孢子油低、中、高劑量組分別為人體推薦劑量的5、10、20倍,即劑量分別為0.2、0.4、0.8 g/kg·bw。各組受試物溶于植物調和油配制。動物適應性喂養7 d后,經口灌胃給予受試物,每日1次,灌胃體積為1 mL/100 g·bw,溶劑對照組給予等量植物調和油,連續干預30 d。

1.4 主要儀器與試劑

AUY120分析天平,日本島津shimadzu公司;D3024臺式高速微量離心機、D3024R臺式高速冷凍離心機、MX-S渦旋混合器,美國賽洛捷克SCILOGEX公司;THZ-82A數顯氣浴恒溫振蕩器,常州朗越儀器制造有限公司;KZ-III-F高速低溫組織研磨儀,武漢賽維爾生物科技有限公司;TL-420D恒溫水箱,江蘇天力醫療器械有限公司;BK-200全自動生化分析儀,山東BIOBASE博科控股集團;SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所。

濃硫酸,成都市科隆化學品有限公司;4%(質量分數,下同)多聚甲醛溶液、蘇木素染液套裝、DAB顯色試劑盒(20×)、 PBS、TritonX-100,中國Biosharp公司;糖原試劑盒,南京建成生物工程研究所;高碘酸-希夫氏反應(periodic acid Schiff reagent, PAS)染液套裝、DAB (SA-HRP) 原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)試劑盒,武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 體重和一般情況

干預期內每隔1周稱量1次小鼠體重并記錄。每天觀察小鼠的一般情況,包括活動狀態、食欲、毛發光澤等。

1.5.2 臟器系數

取第III批小鼠的肝臟和腎臟,稱重并計算臟器系數由公式(1)所示:

(1)

1.5.3 負重游泳實驗

使用第I批的8只小鼠按照《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中緩解體力疲勞檢驗方法進行負重游泳實驗。末次給予受試物30 min后,將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳,水深約30 cm,水溫為(25±1.0) ℃,游泳過程中注意使小鼠四肢保持運動。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間,即負重游泳時間。

1.5.4 糖原、血尿素氮及血乳酸測定

實驗第30天,末次給受試物30 min后,將第III批小鼠置于溫度為30 ℃的水中不負重游泳90 min,休息60 min后立即拔眼球采血。血樣在4 ℃冰箱靜置過夜后離心(3 500 r/min, 15 min),收集血清,用全自動生化分析儀測定BUN。取第III批小鼠左側腓腸肌,按照試劑盒說明書測定肌糖原的含量。取第II批小鼠的肝臟經生理鹽水漂洗后凍存備用,按照試劑盒說明書采用蒽酮比色法測定肝糖原含量。第IV批小鼠在末次給予受試物30 min后采眼內眥血,采血后不負重游泳10 min立即擦干采眼內眥血,休息20 min后再次采眼內眥血,用乳酸儀測定BLD值。血乳酸曲線下面積計算由公式(2)所示:

(2)

1.5.5 組織病理學檢查

取第III批小鼠右側腓腸肌,于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水,蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察腓腸肌病理學變化。PAS染色觀察腓腸肌糖原含量變化,顯微鏡鏡檢并采集圖像,每張切片隨機挑選3個視野拍照,應用Image-Pro Plus 6.0軟件將切片中紫紅色作為判斷所有照片肌糖原沉積(陽性)的統一標準,對每張照片進行分析得出陽性面積占比,陽性面積占比計算由公式(3)所示:

(3)

1.5.6 TUNEL染色觀察腓腸肌細胞凋亡

取第III批小鼠右側腓腸肌,脫水、包埋、切片、脫蠟至水等同1.5.5節,按照TUNEL試劑盒說明書操作,DAB顯色,復染細胞核,最后脫水封片,于顯微鏡下觀察并采集圖像,每張切片隨機挑選3個視野,陽性凋亡細胞核為棕黃色,分析得出TUNEL陽性率,TUNEL陽性率計算由公式(4)所示。

(4)

1.6 統計學處理

所有數據用平均數±標準差表示,采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。服從正態分布和方差齊的數據,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnet’t檢驗;不服從正態分布或方差不齊的數據可進行適當的變量轉化,若轉換后的數據仍方差不齊,則采用Tamhane’s T2法進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 靈芝孢子油對小鼠體重及一般情況的影響

灌胃30 d期間,各組小鼠的一般情況較好,食欲正常,毛發有光澤。與溶劑對照組相比,靈芝孢子油組小鼠更加活潑,喜攀爬嬉鬧。各組小鼠體重變化曲線及增重情況如圖1所示,干預期內,各組小鼠體重穩步增加,但各組間無顯著差異(P>0.05)。

圖1 靈芝孢子油對小鼠體重的影響(n=36)Fig.1 Effect of GLSO on body weight (n=36)

2.2 靈芝孢子油對臟器系數的影響

各組小鼠臟器系數結果如圖2所示,靈芝孢子油各劑量組小鼠的肝臟系數和腎臟系數與溶劑對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

a-肝臟臟器系數;b-腎臟臟器系數圖2 靈芝孢子油對小鼠臟器系數的影響(n=8)Fig.2 Effect of GLSO on liver and kidney coefficient (n=8)

2.3 靈芝孢子油對小鼠負重游泳時間的影響

運動疲勞發生的直接表現是運動耐力下降,而負重游泳時間可直接反映機體的運動耐力情況,即負重游泳時間越長,機體產生疲勞越慢,受試物的抗疲勞效果越好[17-19]。各組小鼠負重游泳時間結果如圖3所示,靈芝孢子油各組小鼠負重游泳時間均高于溶劑對照組,分別增加了1.72%、101.93%和42.30%,其中靈芝孢子油中劑量組與溶劑對照組相比負重游泳時間極顯著延長(P<0.01)。表明靈芝孢子油可提高小鼠的抗疲勞能力。

圖3 靈芝孢子油對負重游泳時間的影響(n=8)Fig.3 Effect of GLSO on weight-bearing swimming time (n=8)注:與溶劑對照組相比,**表示差異極顯著(P<0.01),*表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.4 靈芝孢子油對小鼠血清BUN的影響

BUN是評價人體承受體力負荷能力的敏感指標,反映體內蛋白質氨基酸等含氮物質的分解代謝情況,體內BUN含量與運動負荷呈正相關[20-22]。各組小鼠BUN結果如圖4所示。靈芝孢子油低、中、高劑量組小鼠的BUN水平均極顯著低于溶劑對照組(P<0.01),這表明靈芝孢子油能有效降低機體蛋白質的供能比例,增強機體對耐力運動的適應性。

圖4 靈芝孢子油對血清BUN的影響(n=8)Fig.4 Effect of GLSO on BUN (n=8)注:靈芝孢子油中劑量組由于負重游泳時有1只意外死亡,導致最終樣本為7例。

2.5 靈芝孢子油對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

糖原是機體運動時的首要供能物質,肝糖原和肌糖原分別是機體能量的儲存和利用形式。運動時,機體消耗肌糖原供能,同時消耗肝糖原以維持體內血糖水平,因此運動強度越大,機體內糖原含量越低[23-25]。各組小鼠肝糖原和肌糖原結果如圖5所示。靈芝孢子油各劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原含量與溶劑對照組相比無顯著差異(P>0.05),說明靈芝孢子油對機體的糖原含量無較大影響。由于肌糖原含量是采用第III批小鼠的腓腸肌進行測定,該批小鼠不負重游泳后消耗了較多糖原,因此肌糖原含量整體較低。

a-肝糖原含量;b-肌糖原含量圖5 靈芝孢子油對肝糖原和肌糖原含量的影響(n=8)Fig.5 Effect of GLSO on hepatic and muscular glycogen level (n=8)注:靈芝孢子油中劑量組由于負重游泳時有1只意外死亡,導致肌糖原含量最終樣本為7例。

2.6 靈芝孢子油對小鼠BLD水平的影響

在長時間高強度運動中,肌肉的有氧供能轉變為無氧酵解,糖原被迅速消耗,產生大量乳酸,乳酸在血液中堆積導致體內pH值下降,導致疲勞產生[26-29]。各組小鼠BLD水平及血乳酸曲線下面積如圖6所示。游泳前,各組小鼠的BLD水平之間無顯著差異(P>0.05);游泳后0 min,靈芝孢子油中和高劑量組小鼠的BLD含量均極顯著低于溶劑對照組(P<0.01);休息20 min后,靈芝孢子油各劑量組小鼠的BLD含量均極顯著低于溶劑對照組(P<0.01)。與溶劑對照組相比,靈芝孢子油各劑量組小鼠的血乳酸曲線下面積均極顯著降低(P<0.01),且BLD水平及曲線下面積隨劑量升高而降低,呈現一定的劑量-反應關系,表明靈芝孢子油能有效抑制乳酸生成或加速乳酸分解,起到緩解體力疲勞的作用。

a-游泳前BLD值;b-游泳后0 min的BLD值;c-休息20 min后的BLD值;d-血乳酸曲線下面積圖6 靈芝孢子油對BLD水平及血乳酸曲線下面積的影響(n=12)Fig.6 Effect of GLSO on BLD and area under curve of the blood lactic acid (n=12)

2.7 靈芝孢子油對小鼠組織病理學的影響

HE染色用于觀察腓腸肌病理學變化,PAS染色用于觀察腓腸肌肌糖原含量[30]。HE染色和PAS染色結果見圖7。HE染色顯示各組小鼠肌纖維排列緊密整齊,未見明顯纖維組織或細胞增生及炎細胞浸潤。PAS染色顯示靈芝孢子油高劑量組腓腸肌著色最深。定量分析糖原陽性面積結果見圖8。與溶劑對照組相比,靈芝孢子油高劑量組的肌糖原陽性面積顯著增加(P<0.05),表明靈芝孢子油高劑量組可減少運動后小鼠的肌糖原消耗,但在此前的肌糖原生化檢測中未見此結果,說明靈芝孢子油是否通過調控糖原代謝發揮抗疲勞作用還需進一步研究。

圖7 各組小鼠腓腸肌HE染色和PAS染色情況(×40)Fig.7 The HE staining and PAS staining of gastrocnemius in each group (×40)注:藍色箭頭為PAS染色陽性。

圖8 靈芝孢子油對小鼠腓腸肌糖原的影響(n=5)Fig.8 Effect of GLSO on muscular glycogen level of gastrocnemius (n=5)

2.8 靈芝孢子油對小鼠腓腸肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色用于觀察腓腸肌細胞凋亡情況。TUNEL染色典型示意圖和TUNEL陽性率結果分別見圖9和圖10。TUNEL染色顯示各組均只有少量細胞核中存在棕色顆粒,僅少量細胞凋亡。溶劑對照組存在更多的棕色細胞核,靈芝孢子油低和高劑量組的棕色細胞核較少。TUNEL陽性率結果顯示,與溶劑對照組相比,靈芝孢子油低劑量組凋亡細胞陽性率顯著降低(P<0.05),靈芝孢子油高劑量組陽性率降低但無顯著差異(P>0.05)。TUNEL結果表明靈芝孢子油可能通過降低細胞凋亡來發揮抗疲勞作用。

a-溶劑對照組;b-靈芝孢子油低劑量組;c-靈芝孢子油中劑量組;d-靈芝孢子油高劑量組圖9 各組小鼠腓腸肌TUNEL染色情況(×40)Fig.9 The TUNEL staining of gastrocnemius in each group (×40)注:藍色箭頭為TUNEL染色陽性。

圖10 靈芝孢子油對小鼠腓腸肌細胞凋亡的影響(n=5)Fig.10 Effect of GLSO on apoptotic rate of injured gastrocnemius muscle tissue of mice (n=5)

3 結論

靈芝孢子油可延長小鼠負重游泳時間,減少BUN產生以及加速BLD的清除,依據《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中緩解體力疲勞方法的結果判定,可認為該靈芝孢子油受試物具有緩解體力疲勞的作用,其機制可能與減少糖原消耗及減弱腓腸肌細胞凋亡有關。