四種生防菌對獼猴桃果實腐爛病菌的室內抑制試驗

劉偉光

（廣州市農業科學研究院，廣東廣州 510335）

通過調查可知，在眾多果蔬中，獼猴桃的采后病害情況尤為嚴重，在采后的運輸、儲存、售賣過程中，受到多種因素的影響，大批量獼猴桃出現腐爛情況[1]。從當下國內外對獼猴桃采后病害的研究現狀來看，普遍對采后病害的研究僅限于病原菌鑒定，如軟腐病、灰霉病、黑星病等，對于如何采取生物學技術對獼猴桃采后病害進行有效控制，缺乏具體化的研究成果[2]。此次試驗通過分離獼猴桃果實上的4 種病原菌，然后利用效果較好的生防菌進行測試，深入分析了不同環境下的防治效果差異，進而初步制訂出科學、合理的使用方法，為陜西省寶雞市眉縣控制獼猴桃采后病害提供有效的生物學技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）病菌材料。此次試驗通過病原菌分離法，從具有采后病害的眉縣獼猴桃中分離出4 種病原菌，分別編號為B1、B2、B3、B4。

2）生防材料。采用廣州市農業科學研究院果樹研究所提取的X1、D3-2、GK、BAR1-5 共4 種生防菌種，放入-90 ℃的超低溫冰箱儲存。

3）培養基材料。①生防菌培養基：分別配備黃豆粉培養基、發酵培養基、高氏一號培養基。②病原菌培養基：取30 g 眉縣獼猴桃，加入20 g 瓊脂，用1.5 L 蒸餾水煮沸15 min。

4）儀器材料。海爾超低溫冰箱、PM200 型電子天平、Leica DMLS2 型顯微鏡、培養皿、臺式離心機、恒溫培養箱、微孔過濾膜等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌提取

利用病原菌分離法，將腐爛的眉縣獼猴桃多次消毒后，分割成3 cm 左右的小塊，放入培養基，在26 ℃下，培養至病原菌落直徑在1 cm 以上時，將其挑到事先備好的同規格培養基內，恒溫26 ℃繼續培養；如此反復2～4 次即可，隨后將病原菌挑回眉縣獼猴桃，觀察前后癥狀是否一致，若一致即可將病原菌作為試驗菌種。

1.2.2 致病性檢測

分別將提取出來的4 種病原菌接種到有傷、無傷2 種不同的獼猴桃上，觀察其不同情況下的致病性。

1.2.3 制作無菌液

將生防菌放入發酵培養基，恒溫26 ℃培養48 h，隨后按照15%的接種標準，轉移到備好的黃豆培養基里，繼續發酵，恒溫26 ℃培養120 h，以4 000 r·min-1轉速離心20 min 后，取上方清液過濾即可得到無菌液。

1.2.4 生防菌對病原菌抑制效果檢測

使用3%次氯酸鈉對獼猴桃表面進行10 min 消毒處理，隨后在獼猴桃中央打一小孔，晾干后接種生防菌，再次晾干后，接種病原菌，依次操作完成后，覆蓋一層保鮮膜，常溫下培養120 h 后，與未接種生防菌但接種了病原菌的獼猴桃進行比對，計算抑制效果。

式中：Ce為抑制效果，%；X0為未接種生防菌的獼猴桃侵染直徑，cm；X1為接種了生防菌的獼猴桃侵染直徑，cm。

1）濃度。采用1.2.4 的檢測方法，將生防菌濾液分別稀釋為原液濃度的2 倍、4 倍、6 倍，對獼猴桃依次進行接種，培養120 h 后檢測不同濃度的生防菌濾液抑制效果。2）溫度。按照1.2.4 的檢測方法，分別將接種了生防菌的獼猴桃依次放在0 ℃、10 ℃、20 ℃的恒溫環境中，培養120 h 后，檢測不同溫度下的抑制效果。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃病原菌分離情況

此次試驗通過病原菌分離法，將病變果實中的4 種病原菌提取出來，分別編號為B1、B2、B3、B4，4 種常見病原菌的具體性狀見表1（室溫26 ℃，培養120 h 后的結果）。如表1 所示，B3、B4 病原菌生長速度最快，直徑已經達到了5.5 cm，而B1 病原菌生長速度也相對較快，直徑達到了5.0 cm，B2 病原菌生長速度較慢，直徑僅有3.5 cm。

表1 不同病原菌分離后的性狀情況表

2.2 生防菌抑制效果檢測

此次試驗采用了平板對峙法，將提取到的4 種生防菌進行抑菌效果比對。如表2 所示，4 種生防菌所表現出的抑制效果均較良好，其中X1 生防菌對B3 病原菌的抑制效果相對較好，抑菌帶寬度為8.0 mm，對B1、B2、B4 病原菌的抑制效果接近持平，抑菌帶寬度分別為5.0 mm、5.9 mm 和5.0 mm；D3-2 生防菌對4 種病原菌的抑制效果相差不大，抑菌帶寬度依次為4.8 mm、6.1 mm、4.9 mm 和3.5 mm；GK 生防菌對B1、B3 病原菌的抑制效果均較明顯，抑菌帶寬度依次為8.0 mm 和8.2 mm，而對B2、B4 病原菌的抑制效果相對較差，抑菌帶寬度僅有5.9 mm 和5.5 mm；BAR1-5 生防菌對B1、B3 病原菌的抑制效果尤為突出，抑菌帶寬度分別高達11.5 mm 和12.8 mm，而對B2、B4 病原菌的抑制效果雖沒B1、B3 病原菌那么明顯，但相比其他3 種生防菌也比較可觀，抑菌帶寬度分別為8.5 mm 和9.2 mm。

表2 不同生防菌對病原菌的抑制效果

2.3 不同濃度的生防菌抑制效果測試

如表3 所示，隨著4 種生防菌濃度的不斷稀釋，其整體的防效率也在逐漸降低，其中X1 生防菌對B1病原菌的防效率下降較為明顯，對B2 生防菌的防效率影響較小，在稀釋2 倍時對B4 生防菌的防效率較高；D3-2 生防菌在2 倍、4 倍、6 倍稀釋后，整體的防效率差異不大，呈穩步下降的趨勢；GK 生防菌在稀釋2 倍后，對B2 生防菌的防效率下降尤為明顯，經過6 倍稀釋后，對B2、B3 病原菌的防效率已經呈負數比例，但不同倍數稀釋后，對B1 病原菌防效率的下降趨勢較為緩慢，與4 倍的防效率比，6 倍的防效率僅下降了1.06 個百分點；BAR1-5 生防菌在2 倍稀釋后對B2、B4 病原菌的防效率較高，對B1 病原菌在6 倍稀釋后的防效率比2 倍時有所下降，對B3 病原菌6 倍稀釋后的防效率下降趨勢較小，對比4 倍防效率僅下降了1.40 個百分點。

表3 不同濃度不同生防菌對病原菌的抑制效果檢測

2.4 不同溫度下生防菌抑制效果測試

由于不同生防菌對不同病原菌所產生的防治效果不同，此次在進行溫度測試時，會將4 種生防菌混合起來，以便其能夠充分發揮抑制作用，并計算其整體隨著溫度變化，所產生抑制效果的變化。

如表4 所示，在10 ℃時生防菌的防效率達到了最大值，對不同病原菌的防效率均在50%～60%，防治效果較為明顯；在20 ℃時，由于溫度升高，病原菌的活力增強、侵染速度加快，導致整體防效率偏低，尤其是對B4 病原菌的防效率，呈急劇降低趨勢，防效率僅有9.70%；在0 ℃時，由于溫度相對較低，在導致病原菌活力降低的同時，抑制了生防菌的代謝能力，進而使得對獼猴桃表面的防護效果下降。0 ℃時的整體防效率在25%～40%，對比10 ℃時有所降低；值得注意的是，在0 ℃與20 ℃時，生防菌對B2 病原菌的防效率幾乎持平，由此可知，在低溫與高溫環境中，生防菌對B2 病原菌仍有較好的抑制效果。

表4 不同溫度下混合生防菌對不同病原菌的防效測試

3 結論與討論

3.1 結論

此次試驗通過將眉縣獼猴桃作為試驗材料，采用了病原菌分離法、平板對峙法等多種試驗方法，深入分析了不同濃度、不同溫度對病原菌防治效果的影響。經過鑒定：B1 病原菌屬粉紅鐮孢霉，B2 病原菌屬白地霉，B3 病原菌屬尖鐮孢霉，B4 病原菌屬細交鏈孢霉，上述4 種病原菌均為弱寄生菌。

在不同生防菌對病原菌的抑制測試中，BAR1-5的抑制效果最為顯著，對B1、B2、B3、B4 病原菌的抑菌帶寬度均在8.0 mm 以上，尤其是對B1、B3 病原菌的抑菌帶寬度在11.5 mm 及以上；X1 生防菌對B3病原菌的抑制效果最佳，抑菌帶寬度也達到了8.0 mm；GK 生防菌對B1、B3 病原菌的抑菌帶寬度均在8.0 mm及以上；相比之下，D3-2 生防菌對4 種病原菌抑制效果較差，抑菌帶寬度普遍在3.5～5.0 mm，僅有B2病原菌的抑菌帶寬度達到了6.1 mm。

3.2 討論

控制果蔬采后病害對生物學技術的安全性、防效性要求較高[3]。在有效控制采后病害的同時，需確保不會對人們身體健康造成不良影響[4]。此次試驗選取的生防菌是具有拮抗作用的微生物細菌。BAR1-5 生防菌屬于一種稀有放線菌（假諾卡氏菌），目前，也是首次采用此生防菌進行試驗，對4 種不同的病原菌均有明顯的防治效果[5]。在4 種生防菌中，與GK 生防菌（木葡糖酸醋桿菌）、BAR1-5 生防菌、D3-2（鏈霉菌）相比，X1 生防菌是目前應用最為廣泛的淡紫灰鏈霉菌，X1 生防菌的防治原理主要是利用抑制效果極強的代謝物質，對病原菌進行防治，淡紫灰鏈霉菌對尖孢鐮孢霉有著明顯的防治效果[6]。因此，可以利用分離、提純4 種生防菌代謝物的方式控制果蔬采后病害。