血清miR-31、miR-155和CCL26在潰瘍性結腸炎中預后不良的診斷價值*

陳國雁 尚精娟 李敏虹 張慧君 劉建峰

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院消化內科,上海 200137)

潰瘍性結腸炎是一種慢性非特異性結直腸炎,其發病率呈逐年增高的趨勢,發病確切機制仍不清,可能與免疫、遺傳和外源性因素刺激等密切相關[1-2]。由于病程長,復發率高,嚴重患甚至最終發展為結腸癌。因此,早期了解潰瘍性結腸炎的病情和嚴重程度,有利于早期臨床治療和對疾病的控制[3]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA,參與了疾病發生發展過程,有研究顯示miR-31和miR-155在潰瘍性結腸炎中呈高表達,并與趨化因子配體26(CCL26)的調節具有一定的聯系[4]。現已知CCL26是趨化因子的成員之一,是炎癥反應的重要調控因子[5]。然而潰瘍性結腸炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26異常表達是否對復發具有預測作用仍不清楚。本研究通過對潰瘍性結腸炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26表達,觀察其在潰瘍性結腸炎嚴重程度和復發的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1月—2020年6月在我院收治的潰瘍性結腸炎患者119例,根據Mayo評分將其分為活動期組(評分3～12分)65例和緩解期組(評分≤2分)54例。其中活動期組,男性35例,女性30例,年齡(23～68)歲,平均(42.27±5.83)歲;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月,根據Mayo評分將活動期組患者分為輕度亞組(3～5分)25例、中度亞組(6～10分)22例和重度亞組(11～12分)18例。納入標準：所有患者均符合潰瘍性結腸炎的診斷標準[6];均行腸鏡和病理學檢查,臨床資料完整。排除標準：自身免疫性和腫瘤性疾病;潰瘍性結腸炎出現出血、穿孔、狹窄和梗阻等并發癥;心、肝和腎等臟器功能不全;孕婦和哺乳期婦女;精神性疾病和智力下降者。另選擇同期在我院健康體檢者45例為對照組,其中男性23例,女性22例,年齡(25～65)歲,平均(43.01±4.28)歲。本研究各組患者均簽署知情同意書,經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 血液標本收集 患者入院時抽取肘靜脈血約5 mL左右,在室溫下靜置約20 min,然后采用3000 r/min的離心機離心10 min,離心半徑為15 cm,去上清液約3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待測,采用酶聯免疫吸附試驗測定血清CCL26的表達。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清中miR-31、miR-155 mRNA表達水平 采用TaqMan miRNA試劑盒提取細胞總的RNA,采用實時定量熒光PCR檢測血清中的miR-31和miR-155表達。并根據目標基因的mRNA序列,設計引物,用設計軟件Primer express 3.0軟件設計反轉錄產物為模板,miR-31擴增引物正向：5′-GGCATAGCTGTTGAACTGGG-3′;擴增引物方向：5′-CGATCGTCAGCATCACTAGC-3′;miR-155擴增引物正向：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′;擴增引物方向：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′;U6擴增引物正向：5′-GCGCTTGTGCTTGATCTAA-3′;擴增引物方向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反轉錄后以反轉錄產物為模板,采用實時定量PCR儀上間隙擴增,反應條件為在85 ℃反應3 min,在85 ℃反應20 s,在42 ℃反應40 s,總共循環35次,采用2-ΔΔCt表示miR-31和miR-155的相對表達量。

1.2.3 潰瘍性結腸炎患者內鏡下嚴重程度指數(UCEIS) 根據血管紋理、出血和糜爛和潰瘍進行評分。血管紋理：正常為0分;斑塊狀消失為1分;全部消失為2分;出血：無出血為0分;黏膜滲血1分;腸腔內輕度出血為2分;腸腔內重度出血為3分。糜爛和潰瘍：正常為0分;糜爛為1分;淺表潰瘍為2分;深部潰瘍為3分。總分為0～8分,分數越高病情越嚴重。

1.2.4 隨訪 通過對病史、電話、微信和門診等方式對患者進行隨訪,每個患者均隨訪滿2年,主要了解患者是否有復發、結腸出血、中毒性巨結腸或者惡變為預后不良,否則為預后良好。

1.2.5 觀察指標比較及分析 比較各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的變化;分析各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結腸炎嚴重程度的關系及影響潰瘍性結腸炎預后不良的單因素和多因素分析;評估血清miR-31、miR-155和CCL26水平在2年內潰瘍性結腸炎發生預后不良的診斷價值。

2 結果

2.1 3組一般資料比較 活動期組65例,其中男性35例,女性30例,年齡(23～68)歲,平均(42.27±5.83)歲;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月;病變部位：直腸20例,乙狀結腸21例,左半結腸13例和全結腸11例;緩解期組54例,其中男性26例,女性28例,年齡(22～66)歲,平均(41.96±4.78);病程(4～33)月,平均(22.75±4.06)月;病變部位：直腸16例,乙狀結腸18例,左半結腸12例、全結腸8例;對照組45例,其中男性23例,女性22例,年齡(25～65)歲,平均(43.01±4.28)歲。3組在年齡和性別等基線資料比較差異無統計學意義,具有可比性(P<0.05)。

2.2 3組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比較 潰瘍性結腸炎活動期組血清miR-31、miR-155和CCL26水平明顯高于緩解期組和對照組(P<0.05),而緩解期組明顯高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比較

2.3 血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結腸炎嚴重程度的關系 血清miR-31、miR-155和CCL26水平隨著潰瘍性結腸炎嚴重程度的增加而升高(P<0.05),見表2。

表2 血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結腸炎嚴重程度的關系

2.4 潰瘍性結腸炎出現預后不良的單因素分析 根據隨訪預后的不同分為預后良好組(40例)和預后不良組(25例),UCEIS評分>6分的比例預后不良組明顯高于預后良好組(P<0.01),而血清miR-31、miR-155和CCL26水平預后不良組明顯高于預后良好組

差異有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 潰瘍性結腸炎出現預后不良的單因素分析

2.5 潰瘍性結腸炎影響預后不良的多因素分析 將具有單因素分析具有統計學意義的指標UCEIS評分、miR-31、miR-155和CCL26水平,根據是否出現預后不良進行二元Logistics 回歸,發現UCEIS評分>6分,血清miR-31、miR-155和CCL26水平升高是發生潰瘍性結腸炎預后不良的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 潰瘍性結腸炎影響預后不良的多因素分析

2.6 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結腸炎出現預后不良的診斷效能 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在診斷潰瘍性結腸炎發生預后不良具有較高的診斷效能,根據是否發生預后不良將上述指標進行二元Logistics回歸得y=1.45×XmiR-31+1.69×XmiR-155+1.32×XCCL26-26.76為聯合檢測指標,聯合檢測的靈敏度為80%,特異度為99.4%,AUC為0.963明顯高于單個指標miR-31(z=2.727,P=0.006)、miR-155(z=3.012,P=0.003)和CCL26(z=2.091,P=0.036),而三個指標之間的AUC比較差異無統計學意義(P>0.05),見表5、圖1。

圖1 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結腸炎出現預后不良的AUC比較

表5 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結腸炎出現預后不良的診斷效能

3 討論

潰瘍性結腸炎是腸道內免疫耐受失衡,病變主要累及結腸黏膜層和黏膜下層,目前診斷主要依靠結腸鏡和相關評分量表的評估[7]。最為常見的腸鏡下UCEIS評分能夠反映疾病嚴重程度的指標[8],主要反映血管紋理、出血和糜爛和潰瘍的嚴重程度,相對在內鏡直視下對潰瘍性結腸炎進行病情嚴重程度評估,具有相對準確和快速評估等特點[9]。本研究結果顯示UCEIS評分在潰瘍性結腸炎預后不良組明顯高于預后良好組,并發現UCEIS評分是潰瘍性結腸炎預后不良的獨立影響因素。但由于潰瘍性結腸炎具有反復發作,對病情嚴重程度和預后的評估采用UCEIS評分具有一定局限性和患者的依從性較差[10-11]。因此,臨床上尋找簡單易行,已經獲得的指標在評價潰瘍性結腸炎的預后具有重要的臨床價值。

miR-31作為miRNA的成員之一,參與了機體免疫應答多個環節,與多種感染性疾病和自身免疫性疾病具有重要作用,在維持機體免疫平衡的穩態具有重要作用[12-13],并發現miR-31在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的診療和預后具有密切關系,可能成為臨床監測疾病的靈敏指標[14]。本研究結果顯示潰瘍性結腸炎患者活動期患者血清miR-31表達明顯高于穩定期患者,并且隨著疾病嚴重程度升高而升高,說明miR-31參與了潰瘍性結腸炎疾病的發生發展。miR-31炎性腸病的研究中發現通過促進Th1的細胞因子的轉錄,抑制Th2細胞因子的過度轉錄,從而達到維持Th1/Th2細胞因子的平衡。在潰瘍性結腸炎的組織中發現miR-31表達出現明顯升高,具有促進潰瘍性結腸炎疾病的發生發展[15-16]。在克羅恩病的研究中發現miR-31/IL-25信號軸的調節,從而達到對Th1/Th17介導的炎癥反應進行調控,并且阻斷miR-31的表達有助于克羅恩病的治療[17]。本研究結果顯示預后不良組患者血清miR-31表達水平明顯高于預后良好組,并且發現血清miR-31表達水平升高是2年內出現預后不良的獨立危險因素。本研究發現血清miR-31表達水平>6.72時,在預測潰瘍性結腸炎2年內發生預后不良具有較高的診斷價值,其靈敏度為72%,特異度85%,AUC為0.820說明血清miR-31表達水平是潰瘍性結腸炎預后的重要指標。

miR-155位于人體染色體22號,為非編碼RNA,在轉錄區的第三個外顯子內,在單核巨噬細胞、T細胞和B細胞活化時均有較高表達,而將其敲除后T細胞和B細胞的功能出現明顯受損,說明miR-155在淋巴細胞的發育和免疫功能的激活具有重要作用[18]。在潰瘍性結腸炎的研究發現血清或者組織出現miR-155的高表達,并認為miR-155在潰瘍性結腸炎的發病過程中具有重要臨床意義[19-20]。本研究證實潰瘍性結腸炎活動期患者血清miR-155表達明顯高于穩定期患者和對照組,并且發現隨著潰瘍性結腸炎的嚴重升高而升高,說明miR-155表達水平是潰瘍性結腸炎嚴重程度的指標。本研究發現預后不良組血清miR-155表達明顯高于預后良好組,并認為血清miR-155水平升高是潰瘍性結腸炎預后不良的獨立風險因素。有研究顯示潰瘍性結腸炎結腸黏膜呈高表達,并促進NF-κB信號通路的激活,介導機體釋放大量的炎癥因子參與潰瘍性結腸炎的發生發展過程,在動物實驗中腸道灌入miR-155抑制劑后,結腸黏膜炎癥明顯降低[21-22]。本組研究發現血清miR-155水平>2.66時,其診斷潰瘍性結腸炎預后不良的靈敏度80%,特異度為70%,AUC為0.778說明在潰瘍性結腸炎診斷預后不良具有較高的效能。

CCL26屬于CC家族成員之一,是由77個氨基酸組成,其與CC趨化因子-3結合后,激活機體的嗜酸性粒細胞釋放組胺和炎癥因子,參與機體的過敏和炎癥反應,作為急慢性炎癥的評價指標[23]。本研究結果顯示血清CCL26水平在潰瘍性結腸炎活動期組明顯緩解期組,并且隨著病情嚴重程度的升高而升高,并且發現預后不良患者血清CCL26水平明顯高于預后良好患者,并且發現血清CCL26水平升高是預后不良的獨立危險因子。本研究顯示當血清CCL26>9.66 pg/mL時,在預測潰瘍性結腸炎發生預后不良的靈敏度為80%,特異度為85%,AUC為0.886,說明CCL26在預測潰瘍性結腸炎發生預后不良具有較高的診斷效能。本研究還顯示聯合檢測miR-31、miR-155和CCL26水平在預測潰瘍性結腸炎發生預后不良具有更高的診斷效能,其靈敏度為80%,特異度為99.4%,AUC為0.963明顯優于miR-31、miR-155和CCL26單個檢測水平,說明三者存在某種互補性,可能與均參與了潰瘍性結腸炎的病理生理過程有關。

4 結論

miR-31、miR-155和CCL26與潰瘍性結腸炎的嚴重程度有關,聯合檢測有助于提高對潰瘍性結腸炎2年內發生預后不良的診斷價值。