FGF23對支氣管上皮細胞生長、免疫平衡和上皮間充質轉化的影響*

張舒晨 楊旭東 李丹丹 侯新芳 何喜寧

(1.陜西省康復醫院兒童康復科,陜西 西安 710065;2.西安交通大學基礎醫學院,陜西 西安 710061)

支氣管哮喘作為一種發病率較高的慢性非傳染性疾病,嚴重危害人類健康。支氣管哮喘的病理特征主要表現為氣道的炎癥、重塑和高反應性[1-2]。其中,氣道重塑在支氣管哮喘發生過程中的作用不容忽視。在氣道重塑過程中,氣道上皮屏障受損、上皮細胞黏附減少、上皮細胞向肌纖維母細胞分化。上皮間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是氣道重塑過程中一個復雜的重編程過程,為上皮細胞提供間質表型。EMT的發生是一種多基因調控的生物學過程,其通過幾種不同的途徑發生,在器官發生、組織修復、纖維化、腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用。EMT的發生涉及上皮標志物(E-cadherin)的丟失和間質細胞標志物(N-cadherin、α-SMA和vimentin)的增加。TGF-β1在哮喘患者血清中高表達,并且與氣道重塑密切相關[3]。TGF-β1可誘導支氣管上皮細胞發生EMT,從而加重氣道重塑[4]。因此,抑制EMT是減輕氣道重塑的關鍵。

成纖維細胞生長因子23(Recombinant fibroblast growth factor 23,FGF23)屬于成纖維細胞生長因子(FGFs)超家族成員,主要通過與成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor,FGFR)/Klotho復合物結合來發揮生物學功能[5]。現有研究證實,FGF23通過激活FGFR4誘導心肌細胞肥大生長和增加肝細胞炎性細胞因子的產生[6]。另外,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者血漿中FGF23水平顯著升高,香煙煙霧通過下調Klotho基因和激活氣道上皮中的FGFR4誘導COPD患者的氣道炎癥,該研究認為抑制FGF23或FGFR4可能是針對COPD的一種新的抗炎策略[7]。本課題組前期研究中也發現哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中FGF23水平升高。基于上述研究背景,推測FGF23可能參與了哮喘的氣道重塑及EMT。因此,本研究以人支氣管上皮細胞16HBE為研究對象,旨在揭示FGF23對支氣管上皮細胞生長和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 胎牛血清和RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司,青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司,Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司,重組TGF-β1購自美國R&D公司,IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10 ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司,RIPA裂解緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司,BCA蛋白質測定試劑盒、SDS-PAGE、細胞計數試劑盒-8(CCK-8)和TRIzol試劑購自碧云天生物技術研究所,PVDF膜購自美國Millipore公司,增強型化學發光試劑購自美國Thermo fisher公司,MMLV反轉錄酶購自美國Promega公司,SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司,Triton X-100購自大連美侖生物技術有限公司。本研究中所用的抗體均購自英國Abcam。

1.1.2 實驗細胞及培養 人支氣管上皮細胞16HBE購自美國ATCC公司,培養在含8%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中,培養條件為37 ℃和5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 16HBE細胞轉染 委托上海吉凱基因化學技術有限公司合成FGF23-shRNA重組質粒及shRNA陰性對照質粒(NC-shRNA),使用Lipofectamine 3000轉染試劑對16HBE細胞進行轉染。轉染前1天將16HBE細胞以每孔1×105個細胞接種于500 μL不含抗生素的培養基中,用50 μL無血清培養基稀釋20 pmol NC-shRNA或FGF23-shRNA,用50 μL無血清培養基稀釋1 μL的Lipofectamine 3000。將上述稀釋液混合制備轉染液,輕輕混勻,室溫放置20 min,終體積為100 μL,每孔細胞中加入100 μL轉染液,輕輕搖勻,37 ℃下轉染48 h。

1.2.2 細胞分組和處理 將16HBE細胞分為對照組、NC-shRNA組、FGF23-shRNA組、TGF-β1組、NC-shRNA+TGF-β1組和FGF23-shRNA+TGF-β1組。對照組和TGF-β1組細胞不進行轉染,其他組細胞按照“1.2.1”所述方法進行轉染。轉染后,將各組16HBE細胞按照2 000個/孔(100 μL)的密度接種在96孔板中,對照組、NC-shRNA組和FGF23-shRNA組16HBE細胞用完全培養基正常培養,TGF-β1組、NC-shRNA+TGF-β1組和FGF23-shRNA+TGF-β1組16HBE細胞轉染后分別用含有10 ng/mL的TGF-β1的完全培養基培養48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 16HBE細胞轉染及TGF-β1處理48 h后,去除培養基,加入10 μL的CCK-8試劑和100 μL無血清培養基,37 ℃和5% CO2下孵育4 h。用BioTek微板分光光度計檢測450 nm處的吸光度。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測16HBE細胞上清液中炎癥因子 16HBE細胞轉染及TGF-β1處理48 h后,收集各組細胞上清,4 ℃下以500 r/min離心10 min,取上清液。按說明書檢測IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。

1.2.5 Western blot檢測16HBE細胞中FGF23、Klotho、FGFR4、E-cadherin和α-SMA的蛋白表達水平 將各組16HBE細胞用RIPA裂解緩沖液裂解,裂解物在4 ℃下以15000 r/min離心15 min。使用BCA蛋白質測定試劑盒測定總蛋白質。樣品經10%的SDS-PAGE電泳分離并電轉移到PVDF膜,采用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉處理2 h后,將膜與一抗FGF23(1：1 000)、FGFR4(1：1 000)、Klotho(1：1 000)、E-cadherin(1：3 000)、α-SMA(1：3 000)和β-actin(1：5 000)于4 ℃過夜孵育。然后與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1：3 000)室溫孵育2 h。使用增強型化學發光試劑顯影,β-actin作為內參蛋白。

1.2.6 qRT-PCR檢測16HBE細胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表達 使用TRIzol試劑提取16HBE細胞中總RNA。使用分光光度計檢測260 nm和280 nm處的光密度比,并使用隨機引物和MMLV反轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA。使用ABI PRISM 7500實時PCR系統和SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒對PCR擴增反應。GAPDH作為內參,通過2-ΔΔCT確定目標mRNA水平。引物序列如下：FGF23,正向：5′-GGCCTGATCCACCTGTACACA-3′,反向：5′-ACCACAAAGCCAGCATCCTCT-3′;FGFR4,正向：5′-GTGCTGCCAGAGGAAGACCT-3′,反向：5′-CAGGAGCACAAGCAGAACCA-3′;Klotho,正向：5′-TGTGACAGCCAATGGAATCG-3′,反向：5′-GGTTGATGTCGTCCAACACG-3′;β-actin,正向：5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′,反向：5′-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3′。

1.2.7 免疫熒光染色檢測16HBE細胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達 16HBE細胞轉染及TGF-β1處理48 h后,接種在蓋玻片上用PBS清洗3次,室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌1次,0.5%的Triton X-100處理10 min,PBS洗滌3次,5%牛血清白蛋白孵育30 min。然后將細胞與一抗E-cadherin(1：500)和N-cadherin(1：500)在4 ℃下孵育過夜,再與Alexa Fluor 647標記的羊抗兔IgG二抗(1：500稀釋)在室溫黑暗中孵育1 h。細胞核用DAPI染色15 min。最后在熒光顯微鏡下成像。

2 結果

2.1 16HBE細胞的轉染效率驗證 對16HBE細胞轉染NC-shRNA或FGF23-shRNA后,各組細胞中FGF23的mRNA和蛋白表達水平檢測結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組16HBE細胞中FGF23的mRNA和蛋白的表達水平

2.2 FGF23對TGF-β1誘導的16HBE細胞增殖的影響 對16HBE細胞轉染NC-shRNA或FGF23-shRNA,以及TGF-β1處理48 h后,各組16HBE細胞的增殖能力檢測結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細胞的OD450nm值降低,TGF-β1組OD450nm值升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細胞的OD450nm值降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 CCK-8檢測各組16HBE細胞的增殖情況

2.3 FGF23對TGF-β1誘導的16HBE細胞上清液中炎癥因子的影響 各組16HBE細胞上清液中炎癥因子水平檢測結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組細胞上清液中IFN-γ水平降低,IL-4、IL-17和IL-10水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組16HBE細胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平pg/mL)

2.4 FGF23對TGF-β1誘導的16HBE細胞EMT的影響 各組16HBE細胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達水平檢測結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05);與對照組相比,TGF-β1組細胞中E-cadherin蛋白表達水平降低,α-SMA水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05),見圖3。各組16HBE細胞中E-cadherin和N-cadherin的相對熒光強度結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細胞中E-cadherin相對熒光強度升高,N-cadherin相對熒光強度降低(P<0.05);與對照組相比,TGF-β1組細胞中E-cadherin相對熒光強度降低,N-cadherin相對熒光強度升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細胞中E-cadherin相對熒光強度升高,N-cadherin相對熒光強度降低(P<0.05),見圖4。

圖3 Western blot檢測各組16HBE細胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達水平

圖4 免疫熒光染色檢測各組16HBE細胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達

2.5 FGF23對TGF-β1誘導的16HBE細胞中FGF23-Klotho-FGFR4信號的影響 各組16HBE細胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA和蛋白表達水平檢測結果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達水平均升高(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組細胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達水平均升高,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達水平均降低(P<0.05)。與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達水平均升高(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 qRT-PCR檢測各組16HBE細胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表達水平

圖6 Western blot檢測各組16HBE細胞中FGF23、Klotho、FGFR4的蛋白表達水平

3 討論

支氣管哮喘屬于一種氣道高反應性疾病,支氣管上皮細胞是機體隔絕外界環境的第一道屏障[8]。研究表明,多種外源性刺激可引起支氣管上皮細胞中具有不同生物學功能的基因發生差異表達、釋放炎癥信號,進而引起輔助性T(Th)細胞的活化、免疫失衡以及EMT的發生[9]。因此,本研究以16HBE細胞作為研究對象,觀察FGF23對16HBE細胞生長、免疫平衡以及EMT的影響。

FGF23是FGFs超家族成員,具有調控機體膽汁酸平衡、維持穩態、調節葡萄糖和脂質代謝等作用,FGF23主要通過與Klotho(FGF23的共同受體)及其受體FGFR結合來調節生物學效應[10]。Krick等[7]研究表明,COPD患者血漿FGF23水平升高,FGF23可通過激活FGFR4增加人支氣管上皮細胞中IL-1β的釋放,從而加劇炎癥反應,導致免疫失衡。本研究前期實驗發現哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中FGF23水平升高。研究表明,支氣管上皮細胞再經香煙煙霧等外界刺激后會發生異常增殖,以及促炎細胞因子的過量分泌[11]。此外,TGF-β1可誘導支氣管上皮細胞發生EMT[4]。為了進一步研究FGF23在哮喘發生過程中發揮的作用,本研究觀察下調FGF23對TGF-β1誘導的16HBE細胞增殖的影響,結果表明,TGF-β1誘導了16HBE細胞的異常增殖,而下調FGF23則可抑制16HBE細胞的增殖。目前,也有文獻表明FGF23可促進胃癌細胞的增殖[12]。綜上提示,FGF23具有促進肺組織細胞增殖的作用,而抑制FGF23則可能是防止氣道重塑的一種策略。

當受到外界刺激后,支氣管上皮細胞會分泌白介素、趨化因子和生長因子等一系列細胞因子,這些細胞因子可傳遞炎癥信號、募集多種炎癥細胞,從而引起機體免疫失衡,加重哮喘的嚴重程度[13]。在哮喘的發生發展中,Th細胞相關免疫功能紊亂起著重要作用。Th細胞分為4種亞型：分泌IFN-γ的Th1細胞,分泌IL-4的Th2細胞,分泌IL-17的Th17細胞,以及分泌IL-10的Treg細胞[14]。目前,專家普遍認為Th1/Th2和Treg/Th17的失衡是導致哮喘加重的關鍵因素。Th1細胞可以抑制肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的分化和增殖,Th2型細胞因子可阻止Th1細胞產生細胞因子[15-16]。IFN-γ是促進Th0向Th1分化的關鍵細胞因子,而IL-4是誘導Th2分化的關鍵因子,可推動嗜酸性粒細胞在哮喘患者肺部的聚集[17]。IL-17和IL-10在功能上相互拮抗,IL-17可募集中性粒細胞并吸引嗜酸性粒細胞,進一步加劇哮喘發作[18]。據報道,哮喘患者血清中IL-4和IL-17水平升高,而IFN-γ和IL-10降低[19]。本研究結果顯示,下調FGF23表達升高了TGF-β1誘導的16HBE細胞上清液中IFN-γ和IL-10的水平,而降低了IL-4和IL-17水平。這些結果表明FGF23可能通過改善Th1/Th2和Treg/Th17失衡來調節機體免疫,從而抑制哮喘相關炎癥。

氣道重塑是支氣管哮喘的關鍵病理特征,在氣道重塑過程中,支氣管上皮細胞通過發生EMT來誘發氣道重塑[20]。EMT表現為E-cadherin等上皮標記物的丟失,以及α-SMA和N-cadherin等間充質標記物的表達。本研究結果顯示,下調FGF23表達升高了TGF-β1誘導的16HBE細胞中E-cadherin的蛋白表達水平,并抑制了α-SMA和N-cadherin的表達,從而抑制16HBE細胞的EMT。

已有研究表明,COPD患者氣道中Klotho表達減少[21],Klotho作為協同因子與FGFR結合形成FGFR-Klotho復合物[22],啟動FGF23信號下游分子FGFR4,在缺少Klotho的情況下,FGF23可以激活FGFR4并誘導心肌細胞肥大生長和增加肝細胞炎性細胞因子的產生[6]。此外,Klotho基因敲除的小鼠氣道炎癥加劇,肺內FGFR4表達增加,而Klotho基因的過度表達則可減輕氣道炎癥[7]。本研究結果表明,下調FGF23抑制了TGF-β1誘導的16HBE細胞中FGFR4的表達,并促進了Klotho的表達。這些結果提示通過抑制FGF23-Klotho-FGFR4信號通路可能是治療哮喘的一種有效途徑。

4 結論

下調FGF23抑制了TGF-β1誘導的16HBE細胞的生長和EMT,并改糾正了Th1/Th2和Treg/Th17的失衡。FGF23-Klotho-FGFR4信號可能是哮喘治療的一種分子靶標。