谷胱甘肽通過Nrf2/ARE通路改善四氯化碳誘導大鼠肝損傷和肝纖維化*

梁玉梅 陳維憲 黃群鋒

(1.南方醫科大學珠江醫院藥學部,廣東 廣州 510260; 2.廣州市番禺區婦幼保健院藥劑科,廣東 廣州 511400;3.廣州醫科大學附屬第五醫院腫瘤科,廣東 廣州 510700)

肝纖維化是肝臟在受到外界刺激后發生的自我修復和傷口愈合,導致肝臟中細胞外基質的過度產生和沉積[1-2]。肝纖維化病程遷延而可逆,若無積極有效干預措施可進展為肝硬化,進而引發肝衰竭、肝性腦病、胃食管靜脈曲張破裂出血等一系列嚴重并發癥,給患者造成極大痛苦和死亡風險,同時也給社會帶來了巨大經濟負擔。因此,肝纖維化的早期診斷和有效干預尤為重要,其確診有賴于肝纖維化分子基礎的研究。相關的臨床和實驗研究表明,肝損傷消除后可能會出現纖維化消退[3-4]。肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSCs)的活化是肝纖維化發病機制中的關鍵環節,激活過程的特征是表型從靜止的富含維生素A的表型轉變為肌成纖維細胞的纖維化表型[5]。

許多具有抗氧化作用的人工和天然制劑已被建議用于治療和預防過度氧化應激引起的肝病[6]。因此,補充抗氧化劑對人體健康有益。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一種內源性三肽,肝臟是其含量最高的組織之一。補充內源性谷胱甘肽的有效方法是使用S-酰基前藥,如S-乙酰基-谷胱甘肽(S-acetyl-glutathione,SAG),其能夠穿過細胞膜并增加細胞內SH基團[7]。與直接進入細胞的GSH不同,SAG在血漿中更穩定,一旦進入細胞質,就會被細胞質硫酯酶轉化為GSH。特別是,硫原子的乙酰化避免了谷胱甘肽的分解,并簡化了其通過腸壁的吸收[8]。四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導的肝損傷被廣泛用于人類肝臟疾病的實驗模型和鑒定潛在的肝保護劑。目前已經證實,靶向Nrf2-ARE信號通路可以保護肝臟免受CCl4誘導的損傷[9]。據報道,海地瓜中的膠原蛋白肽通過Keap1/Nrf2-ARE、PI3K/AKT和MAPKs途徑預防CCl4誘導的肝損傷[10]。紅松松仁多糖PNP40c-1通過NRF2/ARE/MKP1/JNK信號通路對CCl4誘導的小鼠肝損傷發揮肝臟保護作用[11]。基于這些研究,我們猜想谷胱甘肽通過Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導大鼠肝損傷和肝纖維化。本研究建立了CCl4誘導的大鼠肝損傷和纖維化的假設來驗證谷胱甘肽對肝損傷、膠原蛋白產生、HSC活化和體內氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 CCl4、GSH購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中國),qRT-PCR引物購自北京擎科生物科技股份有限公司(中國),ALT、AST、ALP、羥脯氨酸測定試劑盒、LPO、MDA、GSH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,IL-6、TNF-a和IL-1β ELISA測定試劑盒購自美國Millipore公司,一抗anti-α-SMA、anti-α1(I)procollagen、anti-fibronectin、anti-TGF-βR1、anti-PDGF-βR、anti-EGFR、anti-Nrf2、anti-ARE和anti-β-actin購自Abcam公司,細胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性檢測試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司。

1.2 動物模型構建 雄性SD大鼠(體重180～220 g)購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。參考前述研究進行[12],用CCl4(0.1 mL/100 g體重)和橄欖油[1∶1(w/v)]的混合物誘導大鼠肝損傷。將32只大鼠按照配對比較法隨機分為4組,每組8只。第1組為對照組,大鼠腹腔注射橄欖油,未注射CCl4或GSH。第2組為CCl4組,大鼠腹腔注射CCl4,未經GSH處理。第3組為低劑量治療組,大鼠靜脈注射CCl4,并灌胃50 mg/kg GSH。第4組為高劑量治療組,大鼠靜脈注射CCl4,并灌胃100 mg/kg GSH。第2至4組大鼠每隔一天腹腔注射CCl4,持續8周。將GSH溶于橄欖油中,在第5至8周每天灌胃一次。實驗結束時,大鼠經腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后處死。采集血液,分離肝臟并稱重。實驗期間,所有大鼠生長良好,未出現死亡。本研究經我院倫理委員會審核批準(批準號：AEWC-2201061)。

1.3 肝組織病理學分析 參考前所述進行蘇木精-伊紅(HE)染色和天狼星紅染色[13],分析肝組織切片的病理變化。

1.4 肝細胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性的測定 將0.1 mL樣品添加到含有70 mM Tris-HCl(pH 7.4)、10.0 mM氨基脲、14 mM MgCl2、215 mM KCl和4 mM NADPH的混合物中,最終體積為1.0 mL。在37 ℃下孵育混合物30 min,之后通過添加1.5 mL 12.5%三氯乙酸來終止反應。在2000 rpm離心1.5 min后,將2 mL上清液與1.0 mL含有6 M乙酸銨、60 mM乙酰丙酮和0.15 M乙酸的NASH試劑混合。然后將試管在70 ℃下孵育20 min,并在415 nm處測量形成的六氯環己烷。CYP2E1活性以每分鐘每毫克蛋白質的納摩爾數表示。

1.5 ELISA檢測相關指標水平 收集大鼠的血清樣本,使用ELISA試劑盒檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的水平;用ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-a和IL-1β水平。

1.6 肝組織羥脯氨酸的測定 將從每只大鼠肝臟隨機切下的三小塊肝組織在110 ℃的6N HCl中水解24 h,隨后用NaOH中和。在水解產物的等分試樣中加入檸檬酸鹽緩沖氯胺T中的異丙醇,然后加入Ehrlich試劑。在60 ℃的避光條件下孵育25 min。離心后,使用96孔板光譜儀在558 nm處讀取每個樣品的上清液的吸光度。

1.7 qRT-PCR檢測基因表達水平 通過Trizol法進行總RNA提取,PrimeScript RT Reagent Kit(Takara,Japan)用于cDNA合成,隨后使用SYBR Green PCR Kit(Takara,Japan)進行qRT-PCR分析檢測基因表達,β-actin分別作為檢測目的基因表達量的內參,引物序列見表1。使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 Western blot檢測蛋白表達水平 肝臟樣品在含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液中勻漿。使用BCA檢測試劑盒(Pierce,USA)測定蛋白水平,蛋白質通過十二烷基硫酸鈉(SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離,轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,USA)上,用含0.1%吐溫20的Tris緩沖鹽水的5%脫脂奶粉封閉。通過相應的一級抗體和隨后的辣根過氧化物酶偶聯的二級抗體檢測目標蛋白。使用化學發光試劑(Millipore,USA)對蛋白質條帶進行可視化。

1.9 檢測脂質過氧化(LPO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的水平 使用LPO、MDA和GSH檢測試劑盒分別測定肝臟組織中LPO、MDA和GSH水平。

2 結果

2.1 谷胱甘肽保護大鼠肝臟免受CCl4誘導的損傷 HE染色結果顯示,CCl4治療誘導了嚴重的肝損傷,表現為彌漫性小葉中心壞死伴全小葉炎癥,而谷胱甘肽預處理減輕了CCl4誘導的壞死和炎癥細胞浸潤,見圖1A;在CCl4治療的大鼠血清中ALT、AST和ALP水平顯著升高,谷胱甘肽劑量依賴性地降低了血清ALT、AST和ALP水平,并且高劑量的谷胱甘肽在降低血清ALT、ALT和ALP水平方面更為顯著(P<0.05),見圖1B;CCl4處理后,大鼠肝臟CYP2E1活性被激活,而谷胱甘肽顯著降低CYP2E1的活性(P<0.05),見圖1C;CCl4導致大鼠血清中IL-6、TNF-a和IL-1β的顯著增加,而谷胱甘肽治療顯著逆轉了這一結果(P<0.05),見圖1D。綜上提示,谷胱甘肽可以改善CCl4注射引起的肝損傷。

圖1 谷胱甘肽保護大鼠肝臟免受CCl4誘導的損傷

2.2 谷胱甘肽可以降低CCl4誘導的大鼠肝臟中膠原蛋白表達 天狼星紅染色檢測大鼠肝臟中膠原蛋白的表達結果顯示,在CCl4誘導的大鼠肝臟中膠原蛋白嚴重沉積,并伴有結節形成,谷胱甘肽可以逆轉這一影響(圖2A);α1(I)型前膠原(α1(I)procollagen)的免疫熒光染色顯示類似的結果(圖2B),表明谷胱甘肽減少了纖維化肝臟中的α1(I)型前膠原表達。肝羥脯氨酸的測定結果顯示,谷胱甘肽以劑量依賴顯著降低了纖維化肝臟中羥脯氨酸的含量(圖2C),表明纖維化肝臟中膠原蛋白的積累減少(P<0.05)。綜上提示,谷胱甘肽可以通過抑制大鼠膠原的表達來減弱CCl4誘導的肝纖維化。

圖2 谷胱甘肽可以降低CCl4誘導的大鼠肝臟中膠原蛋白表達

2.3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的活化 qRT-PCR和Western blot結果顯示,α-SMA、α1(I) procollagen、fibronectin、TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR在mRNA和蛋白水平上的表達顯著增加,表明纖維化肝臟中HSC過度活化。然而,谷胱甘肽治療以劑量依賴性地降低了這些標記物的mRNA和蛋白表達(P<0.05),見圖3。綜上提示,谷胱甘肽抑制了CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的激活。

圖3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的活化

2.4 谷胱甘肽減輕CCl4引起的大鼠纖維化肝臟氧化應激 為了評估谷胱甘肽對體內氧化應激的影響,我們測定了肝組織勻漿中LPO和MDA的水平。CCl4的處理顯著增加了大鼠肝臟LPO和MDA的水平,但谷胱甘肽的治療以劑量依賴的方式降低了LPO和MDA的水平(P<0.05),見圖4A、B;我們的結果發現CCl4處理的大鼠肝臟GSH水平顯著降低,但是通過谷胱甘肽處理以劑量依賴的方式得到改善(P<0.05),見圖4C。提示谷胱甘肽減輕了CCl4給藥引起的大鼠纖維化肝臟的氧化應激。

圖4 谷胱甘肽減輕CCl4引起的大鼠纖維化肝臟氧化應激

2.5 谷胱甘肽促進Nrf2/ARE通路的活性 為了研究Nrf2/ARE信號通路是否參與谷胱甘肽對CCl4誘導的肝損傷的保護作用,我們檢測了Nrf2和ARE在CCl4誘導大鼠肝組織中的表達。結果表明,CCl4處理顯著降低了Nrf2和ARE的表達,而谷胱甘肽顯著提高Nrf2和ARE的表達(圖5A),以上結果提示Nrf2/ARE信號通路可能參與了谷胱甘肽對CCl4誘導的肝損傷的保護作用。為了進一步證實谷胱甘肽對CCl4誘導大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響,我們檢測了Nrf2下游抗氧化基因的表達。結果顯示,CCl4處理后降低的GST、GCLc、NQO1和HO-的表達,而在谷胱甘肽處理后明顯逆轉這一結果(P<0.05),見圖5B～E,進一步驗證了谷胱甘肽可以改善CCl4誘導的大鼠纖維化肝臟氧化應激。

圖5 谷胱甘肽促進Nrf2/ARE通路的活性

3 討論

CCl4誘導肝損傷模型已被廣泛應用于肝臟病理研究,其形態學和生化特征與人類肝臟疾病細胞病變相似[14]。CCl4處理后大鼠肝臟細胞色素P450被激活,然后產生三氯甲基自由基,與細胞大分子共價偶聯,從而影響細胞功能;產生的CCl3攻擊肝細胞膜上的磷脂分子,引起脂質過氧化反應,并破壞肝細胞膜結構和功能的完整性。與此同時,肝組織中SOD、MDA和其他相關脂質過氧化指數的水平發生改變,最終導致肝功能受損[15]。刺激肝細胞向血液中釋放各種酶,包括ALT、AST和ALP,這是肝細胞損傷的標志物[16]。除了上述反應外,CCl4還會引起體內炎癥,導致血液中的炎性細胞因子(IL-6和TNF-α)和肝組織中的炎癥細胞因子(COX-2和PGE2)發生變化[17]。在代謝組學方面,CCl4被人體吸收后,細胞色素P450水平升高,導致一系列脂質過氧化反應,造成三羧酸循環紊亂,其他相關途徑也受到影響[18]。本文研究了谷胱甘肽對CCl4誘導的肝損傷大鼠肝組織病理變化和肝臟指標的影響。結果表明,谷胱甘肽可以降低大鼠血液中的ALT、AST、ALP、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

HSC活化是肝纖維化過程中的關鍵步驟,因為活化的HSC是膠原和其他細胞外基質成分的主要來源。HSC激活的過程伴隨著一系列標志蛋白的上調表達[19]。活化HSC的減少可能導致膠原的產生和沉積減少;另一方面,HSC的激活是由各種細胞因子和趨化因子觸發的,包括TGF-β、PDGF和EGF,從枯否氏細胞、竇內皮細胞和活化的HSC自身釋放[20]。HSC的激活過程與相應受體的上調有關,包括TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR。本研究結果顯示,谷胱甘肽抑制了CCl4大鼠模型中促纖維化受體的表達,表明谷胱甘肽可以阻斷TGF-β、PDGF和EGF通路,從而抑制體內HSC的激活。此外,許多研究表明,HSC中的膠原表達受到這些促纖維化級聯的轉錄調節[21-23]。因此,可以推測谷胱甘肽減少膠原生成可能是這些級聯的中斷所致,有助于抗纖維化的功效。

越來越多的研究表明,氧化應激與不同病因的肝纖維化有關。CCl4在肝臟中的代謝導致脂質過氧化和ROS的產生,ROS可以引發氧化應激過程[24]。在本研究中,我們證實了CCl4損傷肝臟的氧化應激增強,表現為LPO和MDA水平顯著升高。然而,谷胱甘肽顯著消除了大鼠肝臟中LPO和MDA水平的增加,表明氧化應激減弱。此外,氧化應激可能代表HSC激活的直接或間接促纖維化刺激[25-26]。氧化應激的現象伴隨或先于HSC活化和膠原沉積。有證據表明,培養的人或大鼠HSC暴露于促氧化系統或經歷氧化應激的肝細胞釋放的產物的培養基后,I型前膠原基因的表達和合成增加[27]。此外,谷胱甘肽是最豐富的非酶抗氧化劑,在氧化還原系統中發揮著重要作用。本研究發現谷胱甘肽有效地逆轉了纖維化肝臟中GSH含量的減少,表明GSH的恢復可能是谷胱甘肽抗纖維化作用的重要機制之一。

先前研究報道Nrf2/ARE通路參與CCl4誘導的肝損傷[28]。據報道,鮭魚精子DNA通過Nrf2/ARE和線粒體凋亡途徑預防CCl4誘導的小鼠急性肝損傷[9]。Han等[29]發現黃連素通過調節Nrf2-Keap1-ARE和p53信號通路改善CCl4誘導的大鼠肝損傷。另一項研究報道熊果酸通過Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導的大鼠肝纖維化[30-32]。本研究的結果顯示CCl4誘導的大鼠肝臟中Nrf2和ARE的表達受到抑制,而谷胱甘肽可以恢復Nrf2/ARE通路活性,揭示谷胱甘肽可能通過激活Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導的大鼠肝損傷和肝纖維化。

4 結論

谷胱甘肽在體內保護大鼠肝臟免受CCl4引起的損傷和纖維化,這些作用可能與抑制HSC活化和減輕肝臟氧化應激有關;此外,其還可能通過激活Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導的大鼠肝損傷和肝纖維化。