基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測裝置

毛 敏，高志忠，張如超，陳宇杰，劉文琮，張南剛，2

（1.武漢紡織大學電子與電氣工程學院，湖北武漢 430200；2.智能微納醫學檢驗裝備及關鍵技術湖北省工程研究中心，湖北武漢 430200）

血液凝固檢測是心腦血管及血栓類疾病的重要檢測項目，對于患者的早期檢查、術前風險性評估[1]、抗凝藥物口服[2]都有著重要的指導意義。在臨床情況下，精確控制血液凝固和快速逆轉抗凝治療都至關重要[3]。凝血酶原時間（PT）是血凝四項之一，廣泛應用于臨床診斷。該項血凝檢測指標可用于監測患者術前、圍術期和術后血凝狀態[4]，指導患者接受抗凝治療，調節血凝狀態[5]。該指標對患者的輸血指導[6]、創傷性凝血功能障礙的緊急管理、血栓防治[7]、出血量控制和靶向止血治療[8]有重要意義。傳統的血凝檢測是按固定的時間間隔訪問醫院，通過臺式設備進行PT 檢測。這種做法既費時又昂貴，檢測不及時可能帶來不幸的后果[9]?；谖⒘骺丶夹g的診斷儀器有微型化和集成化的特性，高度契合POCT 的發展需求，基于微流控技術的血凝檢測展現出良好的應用前景[10]。該文選擇具有高透氣性且透氣速率穩定的PDMS 材料[11]，通過微加工工藝制作出一種用于血凝檢測的微流控芯片，再依托嵌入式技術、圖像采集與分析技術，研制了基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測裝置。

1 裝置整體設計

該裝置由主控模塊、屏幕模塊、圖像采集模塊、負壓發生模塊組成。檢測裝置整體設計如圖1所示。

圖1 裝置整體設計

主控模塊是整個系統的核心，通過插接件與其他模塊連接。其主要功能是控制其他各模塊實現功能，保證整個系統的正常運行。

屏幕模塊的主要功能是通過觸摸屏顯示GUI 界面來實現與人的觸摸交互。屏幕模塊使用800×480分辨率的5 英寸IPS 屏幕面板，使用并行的24 位RGB接口。觸摸屏幕芯片為GT911，使用的通信接口為IIC。GT911 所允許的最大通信頻率為400 kHz，IIC時鐘線和IIC 數據線接了一個RC 低通濾波器，用以濾除高頻干擾。驅動單片機外設的LTDC 屏幕驅動器的硬件初始化，通過LTDC 驅動RGB565 制式的LCD 屏幕顯示相應內容。檢測裝置運行界面如圖2所示。

圖2 檢測裝置運行界面示意圖

圖像采集模塊包含攝像頭、變焦鏡頭和補光燈。攝像頭對微流控芯片進行圖像采樣，將采集所得的圖像傳入主控模塊。變焦鏡頭則負責圖像采集范圍和焦點的控制。補光燈在攝像頭采集數據時進行補光，輔助合適顏色、亮度的光線，以實現高質量圖像采集。圖像采集的準確性決定了裝置檢測的精確度。裝置所使用攝像頭的快門速度與采樣增益均是可控的，再搭配補光燈，構建了一整套圖像采集系統。傳感器曝光時間、傳感器采樣增益和補光燈強度三者共同決定了采集圖片的曝光度。過高或過低的曝光度都會使得圖像數據失真，合理曝光的圖像才滿足檢測條件。攝像頭驅動程序通過SCCB 總線協議完成對攝像頭傳感器與內置DSP（Digital Signal Processing）的初始化，實現單片機DCMI 接口的硬件初始化，通過DCMI 數據接口實現對攝像頭位圖數據、幀中斷的讀取，進而將完整圖像數據傳回主控芯片，用于后續數據的處理。補光燈驅動程序實現了WS2812 芯片的驅動，通過DMA 總線搬運數據、SPI 總線發送數據，完成對搭載WS2812 芯片的LED 燈珠的亮度、色彩控制，為攝像頭采集過程補光。變焦鏡頭可根據采樣范圍進行位置調整，可以等比例的縮放所拍攝區域的像素，以適配檢測區域的尺寸。攝像頭、變焦鏡頭及補光燈結構布局如圖3 所示。

圖3 圖像采集模塊結構布局圖

負壓發生模塊包括負壓泵和導氣機構。通過A4988 驅動器驅動42H48 步進電機轉動，結合光電傳感器完成負壓泵的復位和運動控制，實現任意速度的運動和任意位置的啟停，配合注射器為微流控芯片提供負壓源。導氣機構通過驅動伺服舵機帶動硅膠氣嘴伸縮實現導氣機構與血凝檢測芯片導氣嘴的接合與分離。導氣機構滿足了微流控芯片與負壓泵的快速替換，同時保證接合的穩定性，為負壓提供一個穩定的氣體通路。通過3D 建模、打印、組裝及調試，血凝檢測裝置實物如圖4 所示。

圖4 血凝檢測裝置實物圖

2 微流控血凝檢測芯設計與制作

該裝置所使用微流控血凝檢測芯片是自主設計和制作的。該芯片具有兩個功能區域：血凝樣本檢測區和叉指負壓區。檢測區微通道處于上層玻璃中，負壓區微通道處于底層PDMS 中，通過鍵合工藝實現整個芯片的裝配。檢測區為蛇形通道，供檢測樣本在負壓驅動下流動；負壓區為叉指型微通道，由于PDMS 具有較好的透氣性和穩定的透氣速率，當一側叉指通道與負壓泵相連時，與檢測區相連的另一側叉指通道中在較短時間內將產生一個穩定的負壓，可用于穩定地驅動檢測區微通道中血液的流動。芯片結構示意圖如圖5 所示。

圖5 芯片結構示意圖

血凝樣本檢測區微通道寬度為500 μm，高度為100 μm，蛇形通道總長度約為160 mm，樣本檢測區通道的內部體積很小，減少了PT 檢測所需的血樣用量和試劑用量。降低了檢測成本。叉指負壓區微通道寬度為400 μm，高度為100 μm，相鄰叉指微通道間隔為160 μm。叉指結構可以更好的利用PDMS 材料的透氣性。

3 凝血酶原時間測試

3.1 檢測原理及方法

血液凝固是一種動態的血液活動[12]，在凝固過程中，可溶性纖維蛋白原轉化為不溶性的纖維蛋白，血液在形態學上將發生變化，逐漸由流動態轉變為不可流動的凝膠態。凝血酶原時間檢測原理是將待測樣本加入過量的含鈣組織凝血活酶，重新鈣化的血漿在存在組織因子時，激活因子X成為Xa，后者使凝血酶原轉化為凝血酶[13]。凝血酶使纖維蛋白原轉化變為不溶性纖維蛋白，在恒定的負壓驅動下，待測血樣將在檢測區微通道中流動，隨著血液黏度變大，流動速度逐漸降低，最后停止流動。測定整個凝固的時間即為待測樣本的凝血酶原時間(PT)。

采用攝像頭對整個血凝過程進行圖像采集，然后對獲得的圖像進行分析處理，即可解析出PT 值。圖像處理過程如下：先將采集的圖像轉為灰度圖像；然后轉為二值圖像；進而對圖像像素進行識別，得出色度占比結果；最后通過解析色度占比曲線來確定檢測起點和終點。

血液流經區域在二值圖像內顯示為黑色占比為P1，血液未流經區域在二值圖像內顯示為白色占比為P2，可定義色度占比為P0=P1（/P1+P2）。通過繪制色度占比曲線（即凝固曲線），再利用一階求導法即可確定凝固終點時間。

3.2 PT測定實驗及結果分析

取某同學血樣作為標準樣本，開展了兩組實驗進行PT 測試實驗；1）實驗組：血樣+凝血檢測試劑；2）對照組：純血樣。

所用檢測試劑是凝血酶原時間測定試劑盒（凍干型，凝固法），每瓶凝血酶試劑都應以瓶體標識體積添加緩沖液，輕輕搖動溶解，復溶后的試劑在-2～8 ℃環境下可保存7 天；采用含有1/10 體積0.109 mol/L 枸櫞酸鈉抗凝液[14-15]的塑料管或硅化玻璃管作為儲血容器進行靜脈采血[16]，采集后輕輕顛倒8 次將血樣與緩沖液混勻，在此過程中應避免溶血及組織液污染[17]。樣本在-2～8 ℃保存時,不宜超過6 h；22～24 ℃保存時,不宜超過2 h[18]。裝置開機后設置相關參數；裝入血凝檢測芯片，點擊“開始測試”按鈕，硅膠吸盤氣嘴在舵機控制下與導氣孔緊密連接，至此等待裝置負壓建立完畢；屏幕提示可以開始注樣時，取37 ℃預熱的凝血檢測試劑0.2 mL 與37 ℃預熱3 min的待測血樣0.1 mL加入塑料中，應當注意，凝血酶試劑預溫不可超過15 min，血樣預溫不宜超過5 min；將二者輕微攪拌混合；然后將混勻后的待測樣本加入血凝檢測芯片進樣孔；然后啟動攝像頭全程采集檢測區圖像；經圖像處理后繪制出的色度占比曲線如圖6 所示，然后利用一階求導法對圖6 所示曲線進行解析。實驗結果如下：實驗組PT 值約為12.8 s，而對照組PT 值趨近于無窮大。

圖6 色度占比曲線

4 結束語

該文提出了一種基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測技術，并完成了微流控芯片及檢測裝置的設計和制作，最后利用血樣標本在該裝置上完成了實驗組和對照組凝血酶原時間的測定，實驗結果準確可靠。該文創新性地將負壓抽取技術與微流控技術相結合，從而實現了POCT 化的血凝檢測，再結合嵌入式技術、圖像采集和分析技術研發出高度集成化的裝置。該裝置具有體積小巧、便于攜帶、操作簡便、檢測成本低、檢測效率高和檢測速度快等優點，可供基層社區醫院使用或者患者居家自測，具有廣闊的市場應用前景。