褪黑素腹腔注射對腦出血大鼠繼發性腦損傷的抑制作用及其機制

蔣義碧，陳鑫，舒藝璇，鄭曉梅

西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川 瀘州 646099

腦出血（ICH）是一種發病率、病死率、致殘率均較高的腦血管疾病，除原發性腦損傷之外，ICH引起的繼發性腦損傷（SBI）是影響患者預后的主要原因［1］。研究顯示，ICH后SBI的發生與炎癥反應密切相關，炎癥小體激活可釋放大量炎癥因子，誘導炎癥級聯反應，從而加重腦組織損傷及神經細胞死亡［2］。細胞焦亡是新近發現的一種高度促炎性程序性細胞死亡方式，主要由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）經典焦亡途徑介導，可在細胞膜上形成孔隙，導致細胞腫脹破裂，細胞內炎癥物質釋放，引起周圍組織強烈的炎癥反應［3］。研究發現，ICH發生后小膠質細胞、神經元均可出現焦亡，而抑制細胞焦亡能夠降低ICH患者的炎癥反應，改善其神經功能［4］。因此，探究能夠減輕ICH患者炎癥反應、減少細胞焦亡的干預措施對于減輕ICH后的SBI具有重要意義。褪黑素是一種主要由松果體合成和分泌的激素，具有抗炎、抗氧化、調節晝夜節律等多種作用［5］。研究顯示，NLRP3炎癥小體是褪黑素發揮抗炎作用的關鍵靶點，褪黑素可通過抑制NLRP3炎癥小體，減輕糖尿病小鼠神經元焦亡和自噬，從而發揮神經保護作用［6-7］。但目前褪黑素對ICH后SBI的影響及其相關機制研究較少，為此我們于2023年3月—10月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級健康雄性大鼠72只，8～10周齡，體質量250～300 g，實驗動物生產許可證號SCXK（川）2023-0017，實驗動物使用許可證號SYXK（川）2023-0065；大鼠飼養環境通風清潔，溫度（22 ± 1）℃，濕度50% ± 20%，每12 h晝夜周期循環，可自由獲取水和食物。主要試劑：褪黑素、褪黑素受體抑制劑Luzindole均購自武漢阿拉丁生物有限公司，蘇木素染液、伊紅染液、ECL化學發光檢測試劑盒、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗、二抗稀釋液均購自美國Aspen公司，白細胞介素18（IL-18）、白細胞介素1β（IL-1β）試劑盒、TUNEL試劑盒均購自武漢科鹿生物科技有限公司。主要儀器：熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies公司，正置熒光拍照顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 ICH大鼠模型建立及褪黑素干預 將72只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、褪黑素組、抑制劑組，每組18只。模型組、褪黑素組、抑制劑組均采用基底節注射膠原酶的方法建立ICH模型：大鼠經3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，于距中線3.0 mm、前囟后1.0 mm處鉆孔，使用5 μL注射器抽取Ⅶ型膠原酶0.6 U，進針深度5.8 mm、注射時長5 min，針頭留于原位約10 min后緩慢拔出；骨蠟封閉鉆孔，縫合切口，碘伏消毒［8］。假手術組僅鉆孔后插入針頭，不注射膠原酶。各組建模后行Longa評分，評分1～3分提示建模成功。模型建立成功后，褪黑素組腹腔注射褪黑素30 mg/kg，抑制劑組腹腔注射Luzindole 30 mg/kg，假手術組、模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續給藥3 d。

1.3 神經功能損傷評估 ①改良神經功能缺損評分（mNSS）：各組分組處理后采用mNSS評估運動、感覺、平衡和反射功能，mNSS越高提示神經功能損傷程度越嚴重。②轉角實驗：各組分組處理后采用轉角實驗評估肢體協調能力。將兩塊擋板相交形成30°夾角，驅趕大鼠至夾角區域，觀察大鼠進入夾角后向左或向右轉身情況，每只測試10次。向左轉身百分比 = 左轉身次數/所有轉身次數 × 100%，向左轉身百分比越高表示損傷越小。③前肢放置實驗：各組分組處理后采用前肢放置實驗評估運動功能。研究人員輕輕抓住大鼠項背部皮膚，使其四肢脫離平面懸空，放松狀態下以其胡須輕觸桌面邊緣，觀察其左前肢成功放置桌面情況，每只測試10次。左前肢成功放置率 = 左前肢成功放置次數/所有放置次數 × 100%，左前肢成功放置率越高表示損傷越小。

1.4 腦組織含水量檢測 采用干濕比重法。各組大鼠神經功能評估結束后抽取尾靜脈血，靜脈注射戊巴比妥鈉150 ～ 200 mg/kg處死，立即分離病灶側大腦半球，用電子分析天平稱量獲得腦組織濕重。將腦組織在（100 ± 5）℃恒溫電干燥器中干燥48 h，稱量獲得腦組織干重。腦組織含水量 = （濕重 - 干重）/濕重 × 100%。

1.5 腦組織病理觀察 采用HE染色。取各組病灶側大腦組織，4%多聚甲醛保存并固定24 h，石蠟包埋、切片、烤片，石蠟切片脫蠟、水洗和脫水。進行HE染色，中性樹膠封片，200倍顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.6 血清IL-18、IL-1β水平檢測 采用ELISA法。取各組大鼠尾靜脈血，4 ℃條件下3 000 r/min離心30 min，取上層血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。檢測450 nm波長處的光密度（OD）值，通過標準曲線計算血清IL-18、IL-1β水平。

1.7 腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。于冰上取各組病灶側血腫周圍腦組織約20 mg，加入TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度及純度。使用EnTurbo? SYBR Green PCR Super Mix試劑盒進行PCR反應，嚴格按照試劑盒說明書操作。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA相對表達量。

1.8 腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白檢測采用Western blotting法。取各組大鼠病灶側血腫周圍腦組織，加入組織蛋白提取劑，冰浴徹底勻漿并確保勻漿液完全裂解。4 ℃條件下，12 000 g/min離心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備蛋白質樣品，取30 μg蛋白，使用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD一抗（稀釋比例均為1∶ 1 000），4 ℃搖床孵育過夜，加入稀釋后的二抗，室溫條件下孵育1 h。ECL發光顯影，Image J軟件檢測條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 腦組織細胞焦亡情況觀察 ①GSDMD陽性小膠質細胞數量：采用雙重免疫熒光染色。取各組大鼠病灶側血腫周圍腦組織，石蠟包埋后進行切片，脫蠟至水，置于檸檬酸鹽緩沖液中。微波爐加熱進行抗原修復，加入3%牛血清白蛋白孵育2 h，加入IBA-1、GSDMD一抗（稀釋比例均為1∶ 200）孵育過夜，次日PBS沖洗5 min × 3次。加入二抗，室溫避光孵育40 min，PBS沖洗5 min × 3次。滴加DAPI染核，室溫避光孵育20 min。抗熒光淬滅封片劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察IBA-1與GSDMD共表達情況并拍照。使用Image J軟件記錄并分析數字圖像，對1 mm2內的GSDMD陽性小膠質細胞進行計數。②TUNEL陽性細胞率：采用TUNEL法。取各組大鼠病灶側血腫周圍腦組織石蠟切片，脫蠟至水；配制工作液，37 ℃水浴鍋孵育20 min；配置破膜液，室溫孵育10 min。取TUNEL試劑盒內的TdT酶、CF488-dUTP綠光反應液、EB平衡緩沖液，按1∶ 5∶ 50的比例進行混合，37 ℃避光孵育1.5 h；滴加DAPI染核，室溫避光孵育30 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，顯微鏡下觀察拍照，計數橫斷面中的TUNEL陽性細胞數。TUNEL陽性細胞率 = TUNEL陽性細胞數細胞總數×100%。

1.10 統計學方法 采用SPSS27.0統計軟件。計量資料采用K-S法檢驗正態性，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本LSD-t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能損傷相關指標及腦組織含水量比較 假手術組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠mNSS及腦組織含水量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。與假手術組比較，褪黑素組、抑制劑組、模型組向左轉身百分比及左前肢成功放置率均降低（P均＜0.05）；與模型組和抑制劑組比較，褪黑素組向左轉身百分比及左前肢成功放置率均升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠mNSS、向左轉身百分比、左前肢成功放置率及腦組織含水量比較（± s）

表1 各組大鼠mNSS、向左轉身百分比、左前肢成功放置率及腦組織含水量比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術組模型組褪黑素組抑制劑組腦組織含水量（%）77.32 ± 1.35 85.88 ± 1.45*79.67 ± 1.40*#82.58 ± 1.50*#△n 18 18 18 18 mNSS（分）1.83 ± 0.75 10.00 ± 1.41*6.17 ± 1.17*#8.00 ± 1.41*#△向左轉身百分比（%）58.33 ± 7.53 28.33 ± 7.53*46.17 ± 8.67*#33.33 ± 10.33*△左前肢成功放置率（%）73.33 ± 10.33 31.67 ± 7.53*48.33 ± 7.53*#35.00 ± 10.49*△

2.2 各組大鼠腦組織病理情況比較 假手術組細胞結構形態完整，排列整齊，分布均一，染色均勻；模型組可見炎癥細胞浸潤，神經細胞腫脹，神經細胞核消失，細胞排列紊亂，細胞組織結構染色加深；與模型組比較，褪黑素組炎癥細胞浸潤減少，細胞腫脹減輕，細胞排列相對整齊，細胞固縮、溶解減少；與褪黑素組比較，抑制劑組細胞形態不規則，排列分布不均，炎癥細胞浸潤增加，固縮壞死細胞數量增加。見OSID碼圖1。

2.3 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較 假手術組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠血清IL-18、IL-1β水平均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較（pg/mL，± s）

表2 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較（pg/mL，± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

IL-1β組別n IL-18 34.30 ± 6.61 90.47 ± 9.37*59.43 ± 6.77*#79.05 ± 6.97*#△假手術組模型組褪黑素組抑制劑組18 18 18 18 65.45 ± 5.92 148.65 ± 8.97*103.62 ± 7.78*#129.68 ± 8.55*#△

2.4 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表達比較 假手術組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對表達量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表3及OSID碼圖2。

表3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對表達量比較（± s）

表3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術組模型組褪黑素組抑制劑組n 蛋白0.11 ± 0.02 0.54 ± 0.04*0.21 ± 0.03*#0.37 ± 0.05*#△NLRP3 mRNA 1.03 ± 0.07 4.11 ± 0.25*2.09 ± 0.22*#3.06 ± 0.23*#△蛋白0.14 ± 0.03 0.49 ± 0.04*0.25 ± 0.04*#0.40 ± 0.02*#△18 18 18 18 Caspase-1 mRNA 1.05 ± 0.05 3.44 ± 0.15*2.25 ± 0.13*#2.90 ± 0.18*#△蛋白0.11 ± 0.03 0.69 ± 0.06*0.25 ± 0.06*#0.52 ± 0.05*#△GSDMD mRNA 1.07 ± 0.05 4.54 ± 0.16*2.36 ± 0.25*#3.78 ± 0.21*#△

2.5 各組大鼠腦組織GSDMD陽性小膠質細胞數量、TUNEL陽性細胞率比較 假手術組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠腦組織GSDMD陽性小膠質細胞數量、TUNEL陽性細胞率均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表4及OSID碼圖3、4。

表4 各組大鼠腦組織GSDMD陽性小膠質細胞數量、TUNEL陽性細胞率比較（± s）

表4 各組大鼠腦組織GSDMD陽性小膠質細胞數量、TUNEL陽性細胞率比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術組模型組褪黑素組抑制劑組n GSDMD陽性小膠質細胞數量（個）TUNEL陽性細胞率（%）18 18 18 18 41.33 ± 6.71 187.67 ± 9.59*131.17 ± 8.89*#165.33 ± 7.58*#△0.93 ± 0.24 11.65 ± 1.48*3.78 ± 1.06*#7.60 ± 1.66*#△

3 討論

ICH后SBI的發生機制十分復雜，主要與神經炎癥反應、腦水腫、血液成分沉積的毒性作用等有關，神經炎癥反應是加重ICH后SBI病情的關鍵因素［9］。炎癥小體是中樞神經系統炎癥與細胞死亡相互作用的關鍵介質，NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛的炎癥小體，既可介導神經炎癥反應，又可介導細胞焦亡［10］。細胞焦亡是一種兼具凋亡和壞死細胞特征的促炎性程序性細胞死亡方式，主要病理表現為細胞膜上出現氣泡狀突出物，形成10～15 nm的小孔隙，同時也可出現核固縮、DNA斷裂，TUNEL染色陽性等；隨后細胞膜內外離子梯度降低，水分子彌散內流及細胞內鉀離子外流，導致細胞內滲透壓增高，細胞腫脹、細胞膜破裂，細胞內容物釋放到細胞外，從而引起炎癥反應、加重組織損傷［11］。

細胞焦亡主要由NLRP3/Caspase-1/GSDMD經典焦亡途徑及Caspase-4/5/11非經典焦亡途徑介導。當機體受到各種病原體及損傷分子模式刺激時可激活NLRP3，其招募凋亡相關斑點樣蛋白、Caspase-1前體（Pro-Caspase-1），并與之組裝形成NLRP3炎癥小體，進而使細胞質中的Pro-Caspase-1形成具有活性的Caspase-1；隨后，活化的Caspase-1既可將IL-18、IL-1β前體轉化為有活性的IL-18和IL-1β，并促進其成熟和分泌，又可切割GSDMD蛋白，將其N-端孔隙形成結構域釋放［12］。GSDMD是細胞焦亡的效應蛋白，在細胞焦亡的各種途徑中均發揮重要作用，GSDMD的N端片段通過溶解磷脂或心磷脂在細胞膜上形成廣泛的氣溶性小孔隙，釋放IL-18、IL-1β等炎癥因子，引起一系列炎癥級聯反應［13］。小膠質細胞在維持中樞神經系統穩態中具有重要作用，而ICH后異常激活的小膠質細胞是NLRP3的主要來源，NLRP3又可以促進炎癥因子釋放、誘導細胞焦亡，進而加劇炎癥反應，形成惡性循環，加重腦組織損傷。研究發現，小膠質細胞焦亡是ICH后繼發性腦損傷的治療靶點［14］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠mNSS、向左轉身百分比、左前肢成功放置率、腦組織含水量均升高，提示ICH大鼠存在SBI。本研究模型組較假手術組TUNEL陽性細胞率升高，表明ICH后發生了細胞焦亡；雙重免疫熒光結果顯示，GSDMD與小膠質細胞定位重合，將ICH后發生焦亡的細胞定位在小膠質細胞；此外，與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18水平以及腦組織中NLRP3、Caspase-1、DSDMD蛋白及mRNA相對表達量均升高，提示ICH后小膠質細胞焦亡的機制可能與NLRP3/Caspase-1/GSDMD經典焦亡途徑的激活有關。

褪黑素是一種廣泛分布于動植物中的內源性吲哚胺，具有強抗氧化及抗炎作用，且具有親水性及親脂性，能夠輕易跨越血腦屏障，發揮神經保護作用［15］。目前研究證實，褪黑素可通過調節NLRP3炎癥小體相關信號通路，在多種疾病中發揮抗焦亡作用［16］。研究發現，褪黑素可通過調節NF-κB/NLRP3信號通路，減輕急性高眼壓所致的視網膜神經元焦亡［17］。另外，褪黑素可通過調節TLR4/NF-κB信號通路，抑制NLRP3炎癥小體激活，減少心肌細胞焦亡，發揮心臟保護作用［18］。在脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷模型中，褪黑素通過激活Nrf2/HO-1信號通路而抑制NLRP3/GSDMD通路，有效減輕肺泡損傷、中性粒細胞浸潤和肺水腫，從而減輕細胞焦亡、提高小鼠存活率［19］。本研究結果顯示，與模型組比較，褪黑素組大鼠神經功能損傷與腦水腫減輕，固縮壞死細胞及炎癥細胞浸潤減少，提示褪黑素可以改善ICH后的SBI，發揮神經保護作用；褪黑素組較模型組腦組織焦亡相關蛋白及mRNA表達均降低，血清IL-18、IL-1β等炎癥因子水平及TUNEL陽性細胞率、GSDMD陽性小膠質細胞數量均降低，提示褪黑素可抑制ICH大鼠腦組織細胞經典焦亡通路，減少小膠質細胞焦亡。另外本研究結果顯示，與模型組比較，褪黑素組ICH大鼠神經功能損傷與腦水腫減輕、固縮壞死細胞及炎癥細胞浸潤減少，故推測褪黑素可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡通路，減少促炎因子釋放及小膠質細胞焦亡，從而改善ICH后SBI，發揮神經保護作用。

Luzindole為褪黑素膜結合位點MT1/MT2受體抑制劑。為進一步證明褪黑素能否改善ICH后SBI，以及其機制是否與NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡途徑有關，本研究對ICH大鼠予以褪黑素受體抑制劑Luzindole干預處理。結果顯示，與褪黑素組相比，抑制劑組大鼠神經功能損傷及腦水腫加重，血清炎癥因子水平及腦組織焦亡相關蛋白、mRNA表達均升高，提示抑制褪黑素受體后可加重ICH大鼠后的SBI，增加炎癥反應及細胞焦亡。此外，褪黑素受體還存在核結合位點，包括類視黃醇孤兒受體α（RORα）和類視黃醇Z受體家族的孤兒受體（RZR），其與細胞分化和炎癥反應有關。因此在本研究中，與模型組比較，抑制劑組可表現出改善神經損傷及減輕細胞焦亡的作用，考慮與褪黑素核結合相關受體發揮作用有關。

綜上所述，褪黑素腹腔注射可減輕ICH大鼠的SBI情況，其機制可能與抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路而減少小膠質細胞焦亡及減輕神經細胞炎癥反應有關。但未來仍需對該通路上游信號的具體調控機制進行探索，另外如何抑制焦亡效應蛋白GSDMD表達而減輕細胞焦亡，也是研究方向之一。