溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因篩選及其機制分析

陳伊倫，錢力匯，李文迪，孫磊濤，丁書凝

1 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，杭州 310053；2 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江省中醫院腫瘤科

結直腸癌是世界上病死率最高的第三大腫瘤類型，近十年來大部分國家結直腸癌的發病率和病死率日益上升，嚴重威脅著人類的健康［1-2］。目前，結直腸癌的治療方式以手術、放療、化療及靶向治療等為主。中醫藥對提高結直腸癌患者的免疫功能、減少腫瘤復發轉移等均具有積極作用，且中醫存在辨證思維、治療法則豐富，在治療過程中具有一定的優勢［3］。中醫將結直腸癌歸入“腸積”“積聚”“腸覃”等，其發病病因包括外感濕熱、飲食不節、情志所傷或正氣虧虛等，陽虛是其發病的關鍵內在因素之一。陽氣虛損，氣不能化，亦不能溫運，致邪毒羈留，壅滯不散，使大腸傳導失司，日久積生于內，發為癌毒，故“溫陽解毒”是中醫治療結直腸癌的主旨［4］。針對臨床中“脾腎陽虛”和“濕熱下注”證型的結直腸癌患者，“四逆湯”和“三黃湯”為主的化裁驗方表現出良好療效，能有效緩解腰膝酸軟、肛門灼熱、腹部陣痛、畏寒肢冷等癥狀。2021年9月—2023年3月，本研究以四逆湯合三黃湯為基礎，提出“溫陽解毒方”，包括附子、炙甘草、干姜、黃連、黃芩、黃柏等6種中藥，并基于網絡藥理學及分子對接技術探討溫陽解毒方治療結直腸癌的有效成分及核心靶基因，并分析其可能的機制，為結直腸癌的治療提供更多新思路?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 結直腸癌相關疾病靶基因獲取 在Genecards數據庫（https：//www.genecards.org/）中，以“Colorectal Cancer”為關鍵詞進行檢索，篩選得到Score值＞中位數的結直腸癌相關疾病靶基因。

1.2 溫陽解毒方有效成分及相關靶基因獲取 在TCMSP數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分別以附子、干姜、炙甘草、黃芩、黃連、黃柏為關鍵詞進行檢索，設置條件為口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥ 0.18，篩選并獲取溫陽解毒方有效成分，OB、DL值越高提示藥物發揮作用特效性越強。根據Related Targets導出有效成分對應的靶基因，與UNIPROT數據庫（https：//www.uniprot.org/）導出的人類相關靶基因進行匹配，獲得溫陽解毒方有效成分的相關靶基因。

1.3 溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因篩選 將“1.1”獲得的結直腸癌相關疾病靶基因與“1.2”獲得的溫陽解毒方有效成分的相關靶基因取交集，并進行標準化處理，轉化為基因名稱，獲得藥物—疾病共同靶基因，即為溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因。將其導入Cytospace3.7.2軟件，構建有效成分—靶基因調控網絡圖。

1.4 溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因篩選 將“1.3”獲得的溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），物種限定為“智人（Homo sapiens）”，設置Score值＞0.4，其他參數保持默認值，得到溫陽解毒方治療結直腸癌潛在靶基因的蛋白質互相作用網絡（PPI）圖。將數據導入Cytoscape軟件進行拓撲學分析，利用Network Analyze功能分析交集基因，綜合參考Degree值、中介中心度和接近中心性，以Degree值＞平均值為篩選條件，確定網絡中的關鍵靶基因。

1.5 核心靶基因的相關功能及機制分析 在String數據庫對所得的預測靶基因進行分析，通過基因本體（GO）數據庫（http：//geneontology.org/）進行核心靶基因的GO功能分析，包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）；通過KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/）進行核心靶基因的KEGG通路富集分析。

1.6 溫陽解毒方關鍵活性成分與核心靶基因的結合效能分析 采用分子對接技術?；赥CMSP數據庫，利用R軟件得到6種中藥重復的關鍵活性成分?；赑ubChem數據庫，下載重復活性化合物的3D結構，利用OpenBabelGUI轉化為mol2格式。從RSCBPDB數據庫下載溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因結構，將上述靶蛋白文件導入PyMOL軟件，進行去水、加氫。使用AutoDock進行分子對接，并計算關鍵活性成分與核心靶基因之間的結合能。配體與受體的結合穩定性與分子對接的結合能呈負相關關系［5］，結合能的絕對值＞5.0表示結合穩定性良好，絕對值＞7.0則表示結合穩定性很高。

2 結果

2.1 溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因篩選結果 在Genecards數據庫篩選得到結直腸癌相關疾病靶基因1 349個。在TCMSP和UNIPROT數據庫篩選得到溫陽解毒方中附子有效成分21種（對應靶基因29個）、干姜有效成分5種（對應靶基因48個）、黃柏有效成分37種（對應靶基因377個）、黃連有效成分14種（對應靶基因110個）、黃芩有效成分36種（對應靶基因399個）、炙甘草有效成分92種（對應靶基因1 518個）；去重后共計相關靶基因269個，與1 349個結直腸癌相關疾病靶基因取交集后，得到溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因131個。有效成分—靶基因調控網絡圖見OSID碼圖1。

2.2 溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因篩選結果 溫陽解毒方治療結直腸癌潛在靶基因的PPI圖見OSID碼圖2。拓撲學分析結果顯示，溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因有6個，分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Akt1）、p53、JUN、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤壞死因子（TNF）。見表1、OSID碼圖3。

表1 溫陽解毒方治療結直腸癌潛在靶基因PPI圖的拓撲學分析結果（排名前15位）

2.3 核心靶基因的相關功能及機制分析結果 GO功能富集分析結果顯示，在BP中核心靶基因對刺激反應調節的反應顯著性最高，其次是對細胞移動、細胞定位、生物黏附及細胞分化等；在CC中核心靶基因主要與膜區、質膜微區、膜筏有關；在MF中核心靶基因對酶結合方面的顯著性最高，其次是與獨立蛋白結合、藥物結合、受體信號結合、蛋白質二聚化等；見OSID碼圖4～6。KEGG通路富集分析結果顯示，核心靶基因主要作用于綜合腫瘤信號通路、細胞衰老信號通路、p53信號通路、TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路等。見OSID碼圖7。

2.4 溫陽解毒方關鍵活性成分與核心靶基因的結合能分析結果 6種中藥的關鍵活性成分共11種，見表2。分子對接結果顯示，Akt1、TNF、EGFR與11種關鍵活性成分均有較低的結合能，見表3；其中TNF與甲基黃連堿、EGFR與β-谷甾醇是溫陽解毒方關鍵活性成分與核心靶基因結合能最低（結合穩定性最高）的兩組，分別為-6.78、-6.56，其分子對接可視化圖見OSID碼圖8、9。

表2 溫陽解毒方6種中藥的關鍵活性成分篩選結果

表3 溫陽解毒方關鍵活性成分與其治療結直腸癌核心靶基因的結合能

3 討論

結直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，主要臨床表現為排便習慣改變、便血、腹瀉、局部腹痛等，晚期則表現貧血、體質量減輕等全身癥狀。溫陽解毒方由四逆湯及三黃湯化裁而來，方中附子、干姜可溫補脾腎之陽，黃連、黃芩、黃柏能夠清熱解毒。四逆湯出自《傷寒論》，主治少陰心腎陽衰寒厥證。藥理研究表明，四逆湯可以通過調節腸道免疫力、減少腫瘤數量和大小、保護結腸黏膜屏障等途徑，干預結直腸癌的發展［6］。此外，四逆湯亦有“深固陽根”之用，其有效成分分別在降低腫瘤細胞增殖活性、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長等方面發揮作用［7］。三黃湯出自《太平圣惠方》，主治火熱內壅、三焦虛煩作渴等。已有研究表明，三黃湯能抑制腫瘤細胞增殖、轉移及其耐藥性，從而發揮增效減毒的效果，有助于改善腫瘤晚期患者的預后［8］。

本研究利用網絡藥理學的方法，篩選得到溫陽解毒方治療結直腸癌的潛在靶基因131個，其PPI圖相關數據的拓撲學分析結果顯示，溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因主要為Akt1、p53、IL-6、TNF、EGFR、MYC，其中以Akt1的Degree值最高。p53是人類常見的癌變基因之一，攜帶突變型p53蛋白的腫瘤病情進展相對較快，放化療反應差，預后不良［9］。研究顯示，黃芩提取物黃芩素能夠通過降低突變p53表達來抑制結直腸癌的進展［10］。這與我們的研究結果一致。同時，p53與黃柏、黃連、黃芩中的活性成分小檗堿、豆甾醇具有高親和性，能誘導細胞凋亡，抑制腫瘤發生［11-12］。 IL-6是與包括腫瘤在內的多種炎癥病變相關的典型細胞因子，經STAT3蛋白上調靶基因表達，可以通過阻滯細胞生長周期來影響腫瘤細胞增殖，或可作為腫瘤的預后標志物之一［13］。TNF基因家族被認為是預測結直腸癌預后、免疫特征和免疫應答率的有效指標［14］。多項研究顯示，附子可通過抑制IL-6、TNF表達，對脾腎陽虛型的結直腸癌患者發揮良好的治療效果［15-16］。黃芩可通過抑制IL-6/STAT3信號通路活化，對濕熱下注型結直腸癌有較好的治療效果［17］。以上研究提示，臨床上可以將IL-6、TNF作為溫陽解毒方治療結直腸癌臨床效果的評價指標。

EGFR在多種腫瘤組織中的表達均升高，且通常與腫瘤進展及預后不良有關，EGFR磷酸化陽性的腫瘤患者生存時間更長［18］。研究顯示，黃連素可通過抑制結腸巨噬細胞中促炎因子IL-6的產生，導致其驅動的EGFR/ERK信號通路受到抑制，有效抑制了EGFR的磷酸化水平，從而發揮抗腫瘤作用［19］。溫陽解毒方或可通過抑制EGFR磷酸化途徑，從而干預結直腸癌的病理變化，這一點未來需進一步研究。MYC在腫瘤細胞中過表達，與谷氨酰胺酶（GLS）、嘌呤代謝酶（PFAS和CAD）、胱硫硫氨酸-β-合酶（CBS）抑制劑之間存在合成致死作用，可能也是溫陽解毒方治療結直腸癌的一種作用機制［20］。因此，溫陽解毒方的有效活性成分作用于Akt1、p53等核心基因，可能在抑制結直腸癌發生發展的過程中發揮了關鍵作用，但其具體作用機制尚不明了。

本研究GO功能和KEGG通路富集分析結果顯示，溫陽解毒方治療結直腸癌的核心基因在PI3K/Akt信號通路具有高顯著性，且通路關聯最多的靶基因為Akt1、EGFR、p53等。PI3K/Akt信號通路突變及表觀遺傳變異是結直腸癌發生的重要分子基礎之一，該信號通路的異常激活會促進腫瘤細胞增殖［21］。Akt1是Akt的主要亞型之一，參與包括細胞代謝、增殖、存活在內的多種生物學過程，是調節細胞存活信號通路的中心節點［22］。研究顯示，黃柏及炙甘草的共有活性成分槲皮素可通過影響Akt1磷酸化，以及下調Akt1激酶表達，從而抑制結直腸癌細胞上皮—間質轉化，并促進內源性大麻素受體（CB1-R）表達，從而抑制PI3K/Akt信號通路激活，發揮控制結直腸癌進展的作用［23］。研究顯示，黃芩素可通過調節PI3K/Akt信號通路中的關鍵酶PTEN活性，抑制缺氧誘導的Akt磷酸化，從而發揮抗腫瘤作用［24］。另有研究顯示，甘草有效成分甘草素能直接抑制PI3K/Akt信號通路活化，減輕結直腸癌患者的炎癥反應，從而抑制腫瘤細胞EMT過程，減少腫瘤轉移［25］。因此，溫陽解毒方發揮抗腫瘤的作用與PI3K/Akt信號通路密切相關，然而其作用于結直腸癌的藥動學、藥代學研究等仍需進一步探討。本研究分子對接結果顯示，溫陽解毒方治療結直腸癌的11種重要成分與6個核心靶基因蛋白之間具有良好的結合能力，其中甲基黃連堿、β-谷甾醇、黃連堿與6個核心靶基因蛋白之間的結合能均較高。因此，甲基黃連堿、β-谷甾醇、黃連堿是溫陽解毒方治療結直腸癌的核心成分，但是其具體作用機制還有待進一步挖掘。

綜上所述，溫陽解毒方治療結直腸癌的核心靶基因有Akt1、p53、JUN、EGFR、ESR1、TNF，其機制可能與調控p53、TNF、PI3K/Akt等信號通路有關。溫陽解毒方主要通過多藥物、多成分、多通路、多靶基因協同發揮抗結直腸癌作用，提示中藥復方在腫瘤防治方面有廣闊的前景，但后期仍需開展多項實驗加以驗證，為豐富臨床用藥種類、防治結直腸癌提供新思路。